액체 크로마토 그래피 / 질량 분석법에 의해 복어 종 유전형하는 개선 된 중합 효소 연쇄 반응 – 제한 단편 길이 다형성 방법을 설명한다. 역상 실리카 모노리스 컬럼 절단 증폭 산물의 분리에 이용된다. 이 방법은 기본 구성을 식별하는 데 유용 올리고 뉴클레오티드의 모노 이소 토픽 질량을 규명 할 수 있습니다.
중합 효소 연쇄 반응 (PCR) -restriction 단편 길이 다형성 (RFLP) 액체 크로마토 그래피 / 전기 분무 이온화 질량 분석법 (LC / ESI-MS)에 의해 유독 복어 종 유전형위한 방법의 향상된 버전을 설명한다. DNA 추출은 실리카 계 막 DNA 추출 키트를 사용하여 수행된다. 세제없이 PCR 완충액을 사용하여 PCR 증폭 한 후, 제한 효소 반응 액을 정제하지 않고 용액에 첨가된다. 역상 실리카 모노리스 컬럼 및 푸리에 변형 Kingdon이 트랩 분석기를 갖는 고해상도 질량 분석기 각각 분리 및 검출을 위해 사용되는 변환. 400 mM의 1,1,1,3,3,3- 헥사 플루오로 -2- 프로판올로 이루어진 이동상은 15 mM의 트리 에틸 아민 (PH 7.9) 및 메탄올 0.4 ㎖ / 분의 유속으로 전달된다. LC / ESI-MS 분석을위한 사이클 시간은 열 평형 포함 8 분이다. 동위 원소 분포 모델 (을)를 갖는 디컨 볼 루션 소프트웨어올리고 뉴클레오티드 f를 질량 스펙트럼으로부터 대응 된 모노 이소 토픽 질량을 계산하는 데 사용된다. 올리고 뉴클레오티드 (범위 26-79 뉴클레오티드)의 분석을 위해 질량 정확도이었다 0.62 ± 0.74 PPM (N = 280) 및 우수한 정확도 및 정밀도는 잠금 질량 표준을 사용하지 않고 180 시간 동안 지속 하였다.
질량 분석 (MS)은 이온화 1,2- 사용되고 핵산, 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 및 전기 분무 이온화 (ESI)의 신속하고 신뢰성있는 식별 허용 기술이다. 말디 방법은 일반적으로 비행 시간 (TOF) 분석기와 결합되고; 그러나, MALDI-TOF MS의인가 짧은 올리고 뉴클레오타이드로 제한된다 (~ 25 개 뉴클레오티드 (NT)) 이후의 프래그먼트, 부가 형성 및 낮은 이온화 효율 1,2- 때문에. 반대로, ESI는 긴 올리고 뉴클레오티드 (> 100 NT)에 적용 할 수 있지만, 다수의 다양한 충전 상태 ([M-NH2]가 N-) 생체 거대 분자로부터 동시에 생성되며, 따라서, 분석 물의 질량 상부를 초과 할 수있는 이온을 청구 분광계의 m / z 범위의 제한. 이것은 대응 질량으로 복잡한 스펙트럼의 해석, 즉, 충전 상태의 일련의 변환을 필요디컨 볼 루션을 통해.
작은 분자의 질량 측정의 모노 이소 토픽 질량의 피크, 즉,의 경우, 각 요소의 가장 일반적인 동위 원소를 함유하는 분자의 질량이 가장 풍부한 3 자연적 관찰 하였다. 분자량이 증가함에 따라, 더 높은 m / z와 모노 이소 토픽 피크 동위 원소 분포의 변화는베이스 라인 노이즈 3-5에 의해 가려된다. 모노 아이소 토픽 피크가 더 이상 kDa의 3~10보다 질량 대 검출되면, 중량 평균 분자량은 모노 이소 토픽 질량 (5) 대신 측정에 사용되지 않는다. 이러한 경우, 각각의 피크의 각각의 하나 다에 의해 분리되는 동위 원소 분포는 관찰 될 수있다 때 TOF, 푸리에 Kingdon이 트랩 분석기 (6)를 수정, 변환 또는 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 등의 고해상도 질량 분석기 분석은 분석을 위해 사용된다. 그러나, 가장 풍부한 피크 (S)는ometimes 평균 분자량 5와 일치하지. 이러한 문제를 정확하게 분석을 결정하는 어려움을 초래할 수 있습니다.
안정 동위 원소의 자연 존재비의 변화와 평균 분자량 결정의 어려움을 감안할 때 모노 이소 토픽 질량의 측정은 생체 분자 3,4의 질량 특성에 적합하다. 실제로, 모노 아이소 토픽 피크가 관찰 여부는, 상기 모노 이소 토픽 질량 모델 검체 4,7-10 계산 이론적으로 관찰 한 동위 원소 분포 패턴을 비교함으로써 추정 될 수있다. 피팅 알고리즘 (8)는 현재 독점 소프트웨어에 통합됩니다.
ESI-MS의 문맥에서, 이중 가닥 DNA, 정제 및 탈염 해리 인해 이온 억제 및 부가 물 형성에 2,10-14 이온화 고장을 피하기 위해 직접 측정에 요구된다. 이러한 절차는 troubl 있습니다esome 그러나, 완전 자동 분석 시스템은 15-20 병원균의 검출을위한 중합 효소 연쇄 반응 (PCR), 샘플 준비 및 ESI-MS와 관련된 상업적으로 개발되어왔다. 또 다른 방법은 분리를위한 액체 크로마토 그래피 (LC)를 소개하고있다. LC는 공존 물질에서 분석의 온라인 분리를 제공하고, 21, 22를 이온화하기 전에 힘든 시료 전처리가 필요하지 않습니다. 그러나, MS 호환 이동상을 사용하여 핵산의 분리는 뉴클레오티드의 음이온 성질 때문에 약물, 펩티드 및 단백질과 같은 대부분의 다른 화합물보다 더 어렵다. LC / MS ESI-가장 성공적인 예는 역상 LC를 이온 쌍의 사용을 포함한다. 1,1,1,3,3,3- 헥사 플루오로 -2- 프로판올의 이동상 (HFIP) -triethylamine (TEA) – 메탄올은 초기 Apffel 등에 의해 제안되었다. 분리 짧은 올리고 뉴클레오티드 (23)를 검출. differentiatio에 대한 LC / ESI-MS의 유전자형의 응용 프로그램병원균 종, 단일 염기 다형성과 짧은 탠덤 반복 N은 더 이상 올리고 뉴클레오티드 1,21,24-33를 분리 할 수 있습니다 모세관 폴리머 모노리스 컬럼을 사용하여보고 된 바있다.
일본과 미국에서는 심각한 식중독을 오인하고 복어 부적절한 제제로 인해 발생하고, 이는 복어의 분포 및 제조 엄격 식품 안전 법규 (34, 35)에 의해 제어되고 있다는 사실에도 불구하고있다. 또한, 복어 추출물을 사용하여 의도적 인 살인 사건은 일본 (36)에서 발생했다. 따라서, 복어 종의 분화는 공중 보건 및 포렌식 조사 관점에서 모두 필요합니다. 자주 복 복어는 다른 종류의 것보다 훨씬 더 고가이기 때문에 또한, 분화 능력은 식품 사기 조사의 문맥에서 필요하다.
여기서, m을 결정하기위한 구체적인 방법역상 실리카 모노리스 컬럼 고분해능 질량 분석기를 사용하여 LC / ESI-MS에 의한 PCR 산물의 질량 onoisotopic 설명한다. 구체적으로, 방법은 MS를 사용하여 동물의 종 분화 제 예인 PCR 제한 단편 길이 다형성 (RFLP) 방법 (37)의 사용에 기초하여 독성 복어 종의 분화를 허용하도록 개발되었다.
DNA를 추출하기 위해, 혈액 및 조직으로부터 DNA를 추출하기위한 상업용 키트는 사소한 변형 (프로 테이나 제 K의 양 용해 액을 원심 분리)로 제조자의 프로토콜에 따라 사용된다. 그러나, 임의 추출 키트 한 세포 DNA가 PCR에 적합한 복구 및 순도로 추출 수로 사용될 수있다. 이 방법은 근육, 지느러미, 간, 난소, 피부 (37)를 사용하여 테스트되었습니다. 핀 때문에, 냉동, 건조 삶은 구운 복어 샘플이 성공적으로 37 시험 하였다 테 K. 신선한로 빠르게 용해을 수있는 넓은 표면적, 특히 적합하다.
상기 증폭 된 PCR 프라이머 세트 (표 1)에 대한 설계 복어 복어의 미토콘드리아 16S 리보솜 RNA 유전자를 증폭한다. 증폭 대상 DNA는 114-115 bp의 (속 Takifugu), 86 bp의 (속 Lagocephalus) (표 5)입니다. developme에 방법을 용이NT, 표적 서열을 가지는 합성 올리고 뉴클레오티드 대신에 정통 복어 표본을 수집하는 참조 용으로 사용되었다. 상기 프라이머 세트는 목적에 대응하여 설정된 또 다른 프라이머로 대체 될 수 있지만, 효소 분해 후 최종 DNA 길이가 성공적 컨벌루션 필요한 질량 스펙트럼의 품질 유지의 관점에서 NT 100 미만이어야한다. 또한, C-트랩 질소 압력은 표적 올리고 뉴클레오타이드는 약 75 이상 NT보다 때 감소와 질량 스펙트럼의 품질 성공 컨벌루션 불충분한다. 이러한 제한은 프로토콜 절에 설명 달리 섀시 내부의 C-트랩 밸브 조정되어야 구 소프트웨어에서 최근 개발을 통해 제어 될 수있다. 샘플 준비에 대해서는, 세정제없이 시약의 사용은 적절한 피크 형상 충분한 피크 강도 안정 유지 시간 (31)의 측면에서 후속 LC 중요하다.
<p c아가씨 = "jove_content">은 PS-DVB 모세관 모노리스 컬럼 21,24-33하는 C 18 역상 미립자 실리카 컬럼 23,40,41 및 소수성 상호 작용 크로마토 그래피 (HILIC) 칼럼 (42)가 LC 사용되어왔다 / 올리고 뉴클레오티드의 ESI-MS 분석. 그중 모세관 모노리스 컬럼 분리 능력의 관점에서 다른보다 우수하지만, 최근의 연구에 사용 된 모세관 모노리스 컬럼 자체 제작 및 계측을 필요로하는 낮은 유량 (2 μL / 분)로 작동시켰다 마이크로 LC 최선을 다하고 있습니다. 간단한 조작을 용이하게하기 위해, 시판되는 열은 더 높은 유속 (100-400 μL / 분)의 긴 올리고 뉴클레오타이드의 분리에 대해 평가 하였다. DNA 이중 가닥 (26, 37, 53 염기쌍)의 세 쌍은 상술 된 열을 이용하여 분리하고,하지만 C 18 π 결합 미립자 실리카 컬럼 및 PS-DVB 모노리스 컬럼의 사이클 시간은 각각 65, 70 분이었다 상기 C의 반면 <sub> 18 π 결합 실리카 모노리스 열은 8 분 (그림 1)이었다. 고려 신속한 분석을 고려하여 C (18) π 결합 실리카 모노리스 열이 제한된 분리 용량에도 불구하고 우리의 목적을 위해 선택되었다; 그러나 개선 된 분리가 요구되는 경우, 나머지 두 개의 열이 이용 될 수있다. 이론적으로, 모노리스 컬럼의 경우가 더 삽입 볼륨없고 이동상 따라서 효율적인 분리 (27)를 가능하게 일관된 경로 길이를 유지하면서, 고상의 기공을 통해 흐르도록 강요된다. 이러한 방법은 대형 분자의 느린 확산로서는, 올리고 뉴클레오티드로서, 특히 생체 거대 분자의 분석에서 발현 될 것이다. 모노리스 컬럼의 실질적인 장점 중 하나는 배압 미립자 실리카 컬럼 (27)보다 낮다는 것이다. 높은 플로우 레이트 (400 μL / 분) 및 낮은 칼럼 온도 (20 ℃)에서의 최대 배압 불구시스템은 MPA는 37 12.5이었다. 이것은 긴 올리고 뉴클레오타이드의 신속한 분석을 위해 C 18 π 결합 실리카 모노리스 컬럼의 이점의 제 증명이다. 높은 유속에 의해, 경계면에서 마이크로 LC 정확한 정렬을위한 전용 장비가 요구되지 않는다. 대신에, 가열 ESI 프로브는 DNA 이중 가닥을 해리 및 후술하는 바와 같이 DNA의 이온화를 지원하기 위해 필요하다.이온 쌍 크로마토 그래피는 일반적으로 뉴클레오티드의 MS 호환 분리를 위해 사용된다. 그러나, 이온 쌍 시약은 일반적 ESI 공정을 방해하고 ESI-MS의 민감도를 감소시킨다. 따라서, HFIP 자주 올리고 뉴클레오타이드의 감도를 향상시키기 위해 상기 이동 단계에 사용된다. 그러나, HFIP (비점 59 ° C)을 메탄올 (비점 65 ℃), 따라서, 용매의 이러한 손실의 pH를 증가시키고, 이온 쌍 시약의 분해를 촉진 (예 : TEA) 전에 계면에서 급속히 증발올리고 뉴클레오티드에서. 본 방법은 350 ℃에서 고온의 질소 가스로 용출액 nebulizes 가열 ESI 프로브를 사용하기 때문에,이 효과가 지나치게 강조 할 수있다. 때문에 미량의 금속 이온 (33) 부가 형성의 감소 유전자형 분석 대신 HFIP-TEA 완충액, 및 ERB Oberacher는 cyclohexyldimethylammonium 아세테이트 (PH 8.4 CycHDMAA)를 권장합니다. 저자 CycHDMAA 자체가 금속 부가 물의 형성을 억제하는 것으로 추론. 문헌에도 불구하고, 상당한 부가 형성은 본 발명의 방법에서 관찰되지 않았다. 또한, HFIP-TEA – 메탄올 계의 주목할만한 장점은 HFIP-TEA – 메탄올 계 얻어진 피크 면적 T.의 86 bp의 증폭 물을 분석시 CycHDMAA 아세토 니트릴 시스템에 의한 것보다 17 배 더 컸다 있다는 poecilonotus (데이터 미도시). HFIP-TEA – 메탄올 계의 하나의 단점은, 그러나, CycHDMAA 아세토 니트릴 시스템에 대해 증가 된 비용이다.
모노 이소 토픽 질량의 계산은 곱셈으로 하전 된 이온의 동위 원소 피크의 분리가 필요합니다. 따라서, 해상도는, 본 분석을 위해 중요하다. 필요한 해상도 전력 검체의 염기쌍 길이에 의존하지만, 수만의 해상력이 종래의 TOF 분석기는 짧은 올리고 뉴클레오티드의 분석을 위해 제한 될 수있다.
표 4에 나타낸 이론 모노 이소 토픽 질량은 분석의 대응하는베이스 조성물로부터 계산 하였다. 대안 적으로, Muddiman는 외. 정확한 질량 (43)로부터베이스 조성물을 계산하는 소프트웨어 애플리케이션을 개발했다. 비슷한 프로그램이 자동 ESI-MS 시스템 16-18로 통합되었다. 측정 된 모노 이소 토픽 질량 항상 고유베이스 조성물 O에 대응하지 않기 때문에 이러한 알고리즘의 사용은 본 방법의 안정성을 향상시킬 수있다피할 수없는 측정 오차로 인한 3 ppm으로의 질량 허용 오차에 날개. 불행하게도, 우리는 본 연구를 위해이 소프트웨어 제품을 얻을 수있다.
본 방법은베이스 조성물의 분석에 기초 구체적 복어 설계된 절차를 포함하지 않기 때문에, 본 모노 이소 토픽 질량 계 종 결정 복어의 분화뿐만 아니라 다른 DNA 다형성의 검출뿐만 아니라, 적합 할 수있다. DNA 다형성의 검출에 관해서는, 전용의 ESI-MS 시스템은 병원체의 검출 15,17,18,20,30 같은 진단 사용하기에 적합 할 수있는 완전 자동화 및 작동이 용이하다. 반대로, 본 발명의 방법은 연구 용도에 적합하므로 일반적인 연구 장비 및 장치와,와 가능하다. ESI-MS는 이미 단일 염기 다형성 13,28,32, 짧은 탠덤 반복 (26)로 인간의 DNA 다형성에 적용되었습니다그리고 미토콘드리아 DNA는 16, 19는 analsis. 마이크로 RNA는 모세관 LC / ESI-MS (44)를 통해 분석 하였다. 이러한 번역 프로그램도 본 방법에 의해 실현 될 수있다. 또한,이 방법은 저온 분리 때문에 항생제의 작용과 리보솜 RNA 올리고 45과 저분자 화합물 간의 상호 작용을 모니터링하는 데 적합 할 수있다. 이러한 경우, 올리고 뉴클레오티드 및 저분자 화합물은 LC / ESI-MS를 사용하는 장점이있는 동시에 검출한다.
계측은 생거 시퀀싱 및 실시간 PCR과 같은 종래 기술과 같이 병렬 분석을 수행하기에 적합하지 않은 한계가있다. 또한, 본 발명의 방법은 단지베이스 조성물과 동일 분자 내의 염기 치환이 구별 될 수없는 식별한다. 그러나, 여기에 설명 된 MS 기반 DNA 분석 정지 기간의 장점을 가질 수있다이러한 전기 영동 및 실시간 PCR 등의 염료 계 기술을 결합 DNA와 비교하여 정확도들.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
Ethanol (99.5+ vol%) | Wako | 054-07225 | For dilution of wash buffers |
TE buffer (pH 8.0) | Wako | 310-90023 | For dilution of DNA sample |
PCR primer | Fasmac | NA | Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier |
Template DNA | Eurofins Genomics | NA | Purified by HPLC by the supplier |
Ultrapurified water | NA | NA | Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation |
Detergent Free 5X Phusion HF Buffer | Thermo Fisher | F-520L | Use instead of the provided buffer of DNA polymerase |
Pfu-X DNA polymerase | Jena Bioscience | PCR-207S | |
dNTP mix (20 mM each) | Jena Bioscience | NA | Supplied with the DNA polymerase |
10× Universal buffer M | Takara Bio | NA | Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl |
Dra I | Thermo Fisher | FD0224 | Restriction enzyme |
Msp I | Thermo Fisher | FD0544 | Restriction enzyme |
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Fluka | 42060-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Triethylamine (TEA) | Fluka | 65897-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | For preparation of calibrant. |
Sodium hydroxide (1.0 M) | Fluka | 72082 | Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid. |
Acetonitrile | Fluka | 34967 | For preparation of calibrant, LC/MS grade. |
Methanol | Kanto | 25185-76 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Water | Thermo Fisher | W6-1 | For mobile phase, LC/MS grade. |
Microcentrifuge tube (0.5 ml) | Eppendorf | 0030123301 | PCR clean grade |
Microcentrifuge tube (1.5 ml) | Eppendorf | 0030123328 | PCR clean grade |
UVette | Eppendorf | 0030106300 | Disposable UV cuvette. |
Gel Green | Biotium | 41004 | Fluorescent DNA stain |
Cosmospin filter G (0.2 μm) | Nakalai Tesque | 06549-44 | Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable. |
300-μl PP screw vial | American Chromatography Supplies | V0309P-1232 | |
Preassembled screw cap and septa | Finneran | 5395-09R | |
Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) | Kyoto Monotech | 2050H30ODS | Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/) |
Monobis C18 guard column | Kyoto Monotech | GCSET-ODS3210 | Holder included. |
Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) | Imtakt | CW036 | C18-bonded particulate silica column |
ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) | Thermo Fisher | 066640 | Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column |
Themo Mixer C | Eppendorf | 5382 000.023 | For digestion of fish tissues. |
Spectrophotometer | Shimadzu | UV-3150 | Quantification of DNA concentration. |
Thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
Portable refrigerator | Twinbird | D-CUBE | For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box. |
Ultimate 3000 liquid chromatograph | Thermo Fisher | NA | |
Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | NA | Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer. |
Protein deconvolution 3.0 | Thermo Fisher | NA | Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide. |