Терруар Концепция толкуется через виноградной ягоды метаболомики и транскриптомика
Summary
В данной статье описывается применение нецелевых метаболомике, транскриптомику и многомерного статистического анализа к виноградным ягодных транскриптов и метаболитов, чтобы получить представление о концепции терруара, то есть, влияние окружающей среды на качество ягодный черт.
Abstract
Терруар относится к сочетанию факторов внешней среды , которые влияют на характеристики культур , таких как виноградной лозы (Vitis Vinifera) в соответствии с конкретной среды обитания и практики управления. В данной статье показано, как некоторые сигнатуры терруар могут быть обнаружены в ягодного метаболом и транскриптома виноградной лозы сорта Corvina с использованием многомерного статистического анализа. Метод сначала требует соответствующего плана отбора проб. В данном примере, конкретный клон сорта Corvina был выбран, чтобы свести к минимуму генетические различия, и образцы были собраны из семи виноградников, представляющих три различных макро-зоны в течение трех сезонов роста. Нецелевой ЖХ-МС метаболомика подход рекомендуется из-за его высокой чувствительности, сопровождается эффективной обработки данных с использованием программного обеспечения MZmine и стратегию идентификации метаболита, основанный на анализе фрагментации дерева. Комплексный анализ транскриптом может быть достигнуто с использованием микрочиповсодержащие зонды покрытия ~ 99% всех предсказанных генов виноградной лозы, что позволяет одновременный анализ всех дифференциально выраженных генов в контексте различных терруара. И, наконец, многомерный анализ данных на основе проекционных методов могут быть использованы для преодоления сильного марочные конкретного эффекта, что позволяет метаболомика и данные транскриптомика быть интегрированы и детально проанализированы с целью выявления информативных корреляции.
Introduction
Анализ данных Крупномасштабное на основе геномов, Транскриптом, протеомов и metabolomes растений обеспечивает беспрецедентное понимание поведения сложных систем, таких как терруара характеристик вина, которые отражают взаимодействие между виноградной лозы растений и окружающей их средой. Поскольку терруар вина могут быть различны, даже если идентичные клоны виноградная лоза выращивается в разных виноградников, анализ геномика мало пользы, так как клональные геномы одинаковы. Вместо этого необходимо посмотреть на корреляции между экспрессией генов и метаболических свойств ягод, которые определяют качество черты вина. Анализ экспрессии генов на уровне транскриптома выгоды от аналогичных химических свойств всех транскриптов, что облегчает количественный анализ путем использования универсальных характеристик, таких как гибридизации с иммобилизованными зондами на микрочипов. В противоположность этому, универсальные аналитические методы в протеомики ай метаболомика являются более сложными из-за огромного физического и химического разнообразия отдельных белков и метаболитов. В случае метаболомике это разнообразие еще более экстремальным, поскольку отдельные метаболиты значительно различаются по размеру, полярности, изобилия и волатильности, поэтому ни один процесс экстракции или аналитический метод предлагает целостный подход.
Среди аналитических платформ, подходящих для нелетучих метаболитов, те, которые основаны на высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС) значительно более чувствительны, чем альтернативные варианты, такие как HPLC с ультрафиолетовым или диодных матричных детекторов (ВЭЖХ-УФ, ВЭЖХ-DAD ) или ядерного магнитного резонанса (ЯМР), но количественный анализ с помощью ВЭЖХ-МС могут влиять такие явления, как эффект матрицы и подавления ионов / улучшения 1-3. Исследование таких эффектов при анализе ягод винограда Корвина с помощью ВЭЖХ-МС с использованием источником ионизации электрораспылением (ВЭЖХ-ESI-MS), показал, что сахара и другие молекулы с самыми низкими временами удерживания были сильно занижены, вероятно, также отражающий большое число молекул в этой зоне, и что обилие других молекул могут быть занижены, завышены или не зависит от матричного эффекта , но нормализация данных для матричного эффекта , казалось, имеют ограниченное влияние на общие результаты 4,5. Описанный здесь способ оптимизирован для анализа средней полярности метаболитов, которые накапливаются на высоких уровнях в виноградных ягод во время созревания, и которые могут оказывать значительное влияние терруара. Они включают в себя антоцианы, флавонолы, флаван-3-олы, процианидины, другие флавоноиды, ресвератрол, стильбены, гидроксикоричными кислоты и гидроксибензойной кислоты, которые вместе определяют цвет, вкус и свойства, связанные со здоровьем вин. Другие метаболиты, такие как сахара и алифатических органических кислот, игнорируются, поскольку Количественное определение с помощью ВЭЖХ-МС является ненадежным из-за матрицы эфт и подавление ионных явлений 5. В пределах диапазона полярности , выбранной с помощью этого метода, подход нецелевой в том , что он направлен на обнаружение , как много различных метаболитов максимально 6.
Методы транскриптомика , которые позволяют тысячи виноградной лозы транскриптов, подлежащих мониторингу одновременно облегчается наличием последовательности генома 7,8 полный виноградной лозы. Ранние методы транскриптомика, основанные на высокой пропускной способности кДНК последовательности развивались с появлением следующего поколения последовательности в набор процедур, описанных в совокупности, как РНК-Seq технологии. Такой подход быстро становится методом выбора для транскриптомике исследований. Тем не менее, большая часть литературы на основе микрочипов, которые позволяют тысячи транскриптов быть количественно параллельно с помощью гибридизации, накопила для виноградной лозы. Действительно, прежде чем РНК Seq стала основной технологией, многие специализированные коммерческие микрочипов платформы былиразработаны позволяя виноградная транскриптомный быть осмотрены в мельчайших подробностях. Среди огромного множества платформ, только два позволил геному анализ транскриптом 9. Наиболее эволюционировали массив позволил гибридизацию до 12 независимых выборок на одном устройстве, что позволяет снизить затраты каждого эксперимента. 12 подмассивы каждая из которых содержит 135000 60-мерных зондов, представляющих 29,549 виноградной лозы стенограммы. Это устройство было использовано в большом количестве исследований 10-24. Эти две платформы теперь было прекращено , но новый заказ микрочипов недавно был разработан и представляет собой более недавнее развитие , поскольку она содержит еще большее количество зондов , представляющих дополнительные недавно обнаруженных генов виноградной лозы 25.
Наборы данных большой продажи, произведенные транскриптомика и Метаболомика анализа требуют подходящих статистических методов для анализа данных, включая многомерные методы для определения корреляции между различной формыs данных. Наиболее широко используемые многомерные методы, основанные на проекции, и они могут быть без присмотра, например, анализа главных компонент (PCA), или под контролем, такие как двунаправленного ортогональной проекции на латентные структуры дискриминантный анализ (O2PLS-DA) 26. Протокол, представленные в этой статье используется РСА для анализа поисковых данных и O2PLS-DA для выявления различий между группами образцов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В данной статье описываются метаболомике транскриптомика и протоколы статистического анализа, используемые для интерпретации концепции терруар винограда ягоды. Анализ Метаболомика с помощью ВЭЖХ-ESI-MS достаточно чувствительны, чтобы обнаружить большое количество метаболитов одновр…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 “An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine”. This work was supported by the ‘Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale’ project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the ‘Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)’ project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project “The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions”.
Materials
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5×2.1mm; 5μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150×2.1mm; 3μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | – | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In – One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | – | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | – | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus – 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | – | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
Riferimenti
- Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
- Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go?. Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
- Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
- Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
- Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
- Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
- Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
- Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
- Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M., Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. 11, (2012).
- Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
- Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
- Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
- Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
- Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
- Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
- Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
- Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
- Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
- Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
- Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
- Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
- Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
- Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).
