De Terroir Concept Uitgelegd door de Bes van de Druif Metabolomics en Transcriptomics
Summary
Dit artikel beschrijft de toepassing van ongerichte metabolomics, transcriptomics en multivariate statistische analyse om druivenbes transcripties en metabolieten om inzicht te krijgen in het terroir concept, dat wil zeggen, de invloed van de omgeving op bes kwaliteitskenmerken.
Abstract
Streek verwijst naar de combinatie van omgevingsfactoren die de eigenschappen van gewassen beïnvloeden, zoals grapevine (Vitis vinifera) volgens bepaalde habitats en beheerspraktijken. Dit artikel laat zien hoe bepaalde terroir handtekeningen kunnen worden gedetecteerd in de bessen metaboloom en transcriptoom van de wijnstok cultivar Corvina met behulp van multivariate statistische analyse. De methode vereist eerst een geschikte bemonsteringsplan. In deze case study, een specifieke kloon van de Corvina cultivar werd geselecteerd om genetische verschillen te minimaliseren, en monsters werden verzameld van zeven wijngaarden vertegenwoordigen drie verschillende macro-zones tijdens drie verschillende groeiseizoenen. Een ongerichte LC-MS metabolomics aanpak wordt aanbevolen vanwege de hoge gevoeligheid, begeleid door een efficiënte verwerking van gegevens met behulp van MZmine software en een metaboliet identificatie strategie gebaseerd op fragmentatie boom analyse. Uitgebreide transcriptoom analyse kan worden bereikt met behulp van microarraysprobes die ~ 99% van de voorspelde genen grapevine, waardoor de gelijktijdige analyse van differentieel tot expressie gebrachte genen in de context van verschillende terroirs. Tenslotte kunnen multivariate data analyse gebaseerd op de projectie methoden worden toegepast om de uitstekende sterke-specifiek effect te overwinnen, waardoor de metabolomics en transcriptomics data te integreren en in detail geanalyseerd om informatieve correlaties te identificeren.
Introduction
Grootschalige data-analyse op basis van de genomen, transcriptomes, proteomen en metabolomes van planten biedt ongekend inzicht in het gedrag van complexe systemen, zoals de streek kenmerken van wijn die de interacties tussen grapevine planten en hun omgeving weerspiegelen. Omdat de streek van een wijn duidelijk kan zijn, zelfs wanneer identieke grapevine klonen worden gekweekt in verschillende wijngaarden, genomics-analyse is van weinig nut, omdat het klonen genomen zijn identiek. In plaats daarvan moet kijken naar correlaties tussen genexpressie en de metabolische eigenschappen van de druiven waarvan de kwaliteitskenmerken wijn bepalen. De analyse van genexpressie op het niveau van de transcriptoom voordelen van de vergelijkbare chemische eigenschappen van alle transcripten, kwantitatieve analyse vergemakkelijkt door gebruik algemene kenmerken zoals hybridisatie met geïmmobiliseerde probes op microarrays. Daarentegen universele analysemethoden in een proteomicsnd metabolomics zijn meer uitdagend vanwege de enorme fysieke en chemische diversiteit van individuele eiwitten en metabolieten. In het geval van metabolomics deze diversiteit is nog extremer omdat individuele metabolieten sterk verschillen in grootte, polariteit, overvloed en de volatiliteit, dus geen enkele extractieproces of analytische methode biedt een holistische benadering.
Onder de analytische platforms geschikt voor niet-vluchtige metabolieten, die uit hoogwaardige vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (HPLC-MS) zijn veel gevoeliger dan alternatieven zoals HPLC met ultraviolet of diode array detector (HPLC-UV, HPLC-DAD ) of kernmagnetische resonantie (NMR) spectroscopie, maar kwantitatieve analyse met HPLC-MS kan worden beïnvloed door verschijnselen zoals matrixeffect en ion onderdrukking / verbetering 1-3. Het onderzoek naar dergelijke effecten bij de analyse van Corvina druivenbessen met HPLC-MS met behulp van een elektrospray ionisatiebron (HPLC-ESI-MS) toonde dat suikers of andere moleculen met de laagste retentietijden waren sterk underreported, waarschijnlijk mede als gevolg van het grote aantal moleculen in deze zone, en dat de overvloed aan andere moleculen kan worden onderschat, overschat of beïnvloed door de matrixeffect , maar de gegevens normalisering van de matrix effect leek te beperkte impact hebben op de algemene resultaten van 4,5 te hebben. De hierin beschreven werkwijze is geoptimaliseerd voor de analyse drager polariteit metabolieten die zich ophopen bij hoge niveaus druivenbessen tijdens het rijpen en die aanzienlijk worden beïnvloed door de streek. Zij omvatten anthocyanen, flavonolen, flavan-3-ols, procyanidins, andere flavonoïden, resveratrol, stilbenen, hydroxykaneelzuren en hydroxybenzoëzuur zuren, die samen de kleur, smaak en gezondheid-gerelateerde eigenschappen van wijnen te bepalen. Andere metabolieten zoals suikers en alifatische organische zuren, worden genegeerd omdat kwantificatie met HPLC-MS onbetrouwbaar door de matrix en effect en ion onderdrukking verschijnselen 5. Binnen het bereik polariteit geselecteerd door deze werkwijze is de benadering irrelevante omdat hij tot doel zoveel mogelijk verschillende metabolieten detecteren mogelijk 6.
Transcriptomics methoden die het mogelijk maken duizenden grapevine transcripten gelijktijdig te bewaken worden vergemakkelijkt door de beschikbaarheid van de volledige grapevine genoomsequentie 7,8. Vroege transcriptomics methoden op basis van hoge doorvoer sequentiebepaling cDNA geëvolueerd met de komst van de volgende generatie sequencing in een verzameling procedures collectief omschreven als RNA-Seq technologie. Deze aanpak is hard op weg de methode van de keuze voor transcriptomics studies. Echter een grote hoeveelheid literatuur gebaseerd op microarray, waarmee duizenden transcripten parallel worden gekwantificeerd door hybridisatie is opgebouwd voor wijnstokken. Sterker nog, voor RNA-Seq werd een mainstream-technologie, hadden vele toegewijde commerciële microarray platformenontwikkeld waardoor grapevine transcriptoom in detail te inspecteren. Onder de grote verscheidenheid aan platforms, slechts twee toegestaan genoom-brede transcriptoom analyse 9. De verst ontwikkelde matrix kon de hybridisatie van tot 12 onafhankelijke monsters op een enkel apparaat, waardoor de kosten van elk experiment verminderen. De 12 sub-arrays elk omvatte 135.000 60-mer probes die 29.549 grapevine transcripten. Dit apparaat is gebruikt in een groot aantal studies 10-24. Deze twee platforms zijn inmiddels gestopt, maar een nieuwe aangepaste microarray is onlangs ontwikkeld en vertegenwoordigt een meer recente ontwikkeling als het een nog groter aantal probes die extra nieuw ontdekte genen grapevine 25 bevat.
De grote verkoop datasets geproduceerd door transcriptomics en metabolomics analyse vereisen een geschikte statistische methoden voor data-analyse, met inbegrip van multivariate technieken om correlaties tussen de verschillende vorm bepalens data. De meest gebruikte multivariate technieken zijn die op basis van projectie, en deze kunnen zonder toezicht, zoals principale componenten analyse (PCA), of worden gecontroleerd, zoals bidirectionele orthogonale projectie latente structuren discriminerende analyse (O2PLS-DA) 26. Het protocol in dit artikel maakt gebruik van PCA voor de experimentele data-analyse en O2PLS-DA om de verschillen tussen groepen van de monsters te identificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft de metabolomics, transcriptomics en statistische analyse protocollen die worden gebruikt om de druivenbes terroir begrip interpreteren. Metabolomics analyse met HPLC-ESI-MS is gevoelig genoeg om grote aantallen metabolieten gelijktijdig detecteren, maar de relatieve kwantificering wordt beïnvloed door de matrixeffect en ion onderdrukking / verbetering. Er is echter een soortgelijke aanpak reeds zijn gebruikt om de rijping en post-harvest verdorren van Corvina bessen te beschrijven, en de correcti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 “An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine”. This work was supported by the ‘Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale’ project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the ‘Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)’ project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project “The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions”.
Materials
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5×2.1mm; 5μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150×2.1mm; 3μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | – | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In – One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | – | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | – | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus – 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | – | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
Riferimenti
- Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
- Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go?. Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
- Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
- Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
- Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
- Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
- Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
- Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
- Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M., Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. 11, (2012).
- Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
- Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
- Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
- Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
- Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
- Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
- Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
- Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
- Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
- Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
- Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
- Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
- Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
- Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).
