Il concetto Terroir interpretato attraverso uva a bacca Metabolomica e Trascrittomica
Summary
Questo articolo descrive l'applicazione di metabolomica non mirati, trascrittomica e l'analisi statistica multivariata per le trascrizioni di bacche di uva e metaboliti al fine di ottenere una visione nel concetto terroir, vale a dire, l'impatto dell'ambiente sulla caratteristiche qualitative di bacche.
Abstract
Terroir si riferisce alla combinazione di fattori ambientali che influenzano le caratteristiche delle colture quali vite (Vitis vinifera) in base a particolari habitat e pratiche di gestione. Questo articolo mostra come certe firme terroir possono essere rilevati nel metaboloma bacche e trascrittoma della Corvina vite cultivar utilizzando l'analisi statistica multivariata. Il primo metodo richiede un piano di campionamento adeguato. In questo caso di studio, un clone specifico della cultivar Corvina è stato scelto per ridurre al minimo le differenze genetiche, ed i campioni sono stati raccolti da sette vigneti che rappresentano tre diverse macro-zone nel corso di tre diverse stagioni di crescita. Un approccio non mirati LC-MS metabolomica è raccomandato a causa della sua alta sensibilità, accompagnato da trattamento efficiente dei dati utilizzando il software MZmine e una strategia di identificazione metabolita sulla base dell'analisi albero frammentazione. analisi del trascrittoma completa può essere effettuata mediante microarraycontenenti sonde copre ~ 99% di tutti i geni di vite previsti, consentendo l'analisi simultanea di tutti i geni differenzialmente espressi nel contesto di diversi terroir. Infine, l'analisi dei dati multivariati basato su metodi di proiezione può essere utilizzato per superare il forte effetto specifico epoca, permettendo ai metabolomica e dati trascrittomica da integrare e analizzati in dettaglio per identificare correlazioni informativi.
Introduction
l'analisi dei dati su larga scala basata sui genomi, la trascrittomica, proteomi e metabolomes di piante fornisce una visione senza precedenti sul comportamento di sistemi complessi, come ad esempio le caratteristiche terroir di vino che riflettono le interazioni tra piante di vite e il loro ambiente. Poiché il terroir di un vino può essere distinto anche quando cloni di vite identiche sono coltivate in vigneti diversi, l'analisi genomica è di scarsa utilità, perché i genomi clonali sono identici. Invece è necessario esaminare le correlazioni tra l'espressione genica e le proprietà metaboliche dei frutti di bosco, che determinano le caratteristiche qualitative del vino. L'analisi dell'espressione genica a livello delle prestazioni trascrittoma dalle proprietà chimiche simili di tutte le trascrizioni, che facilita l'analisi quantitativa sfruttando caratteristiche universali come ibridazione di sonde immobilizzate su microarray. Al contrario, i metodi analitici universali proteomica unND metabolomica sono più difficili a causa della enorme diversità fisica e chimica delle singole proteine e metaboliti. Nel caso di metabolomica questa diversità è ancora più estremo, perché i singoli metaboliti differiscono notevolmente in termini di dimensioni, la polarità, l'abbondanza e la volatilità, in modo che nessun singolo processo di estrazione o metodo analitico offre un approccio olistico.
Tra le piattaforme analitici adatti per i metaboliti non volatili, quelli basati sulla cromatografia liquida ad alta prestazione accoppiata alla spettrometria di massa (HPLC-MS) sono molto più sensibili rispetto alle alternative quali HPLC con raggi ultravioletti o diodi rivelatori a serie (HPLC-UV, HPLC-DAD ) o spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), ma l'analisi quantitativa mediante HPLC-MS può essere influenzata da fenomeni quali l'effetto matrice e soppressione ionica / enhancement 1-3. L'indagine di tali effetti durante l'analisi di acini d'uva Corvina mediante HPLC-MS utilizzando una sorgente di ionizzazione elettrospray (HPLC-ESI-MS), ha mostrato che gli zuccheri e le altre molecole con i tempi di ritenzione più bassi sono stati fortemente underreported, probabilmente riflette il gran numero di molecole in questa zona, e che l'abbondanza di altre molecole potrebbe essere sottostimato, sopravvalutati o influenzato dalla effetto matrice , ma la normalizzazione dei dati per l'effetto della matrice sembrava avere impatto limitato sul risultato 4,5 complessiva. Il metodo descritto nel presente documento è ottimizzato per l'analisi dei metaboliti medio di polarità che si accumulano ad alti livelli nel acini d'uva durante la maturazione, e che sono significativamente influenzato dal terroir. Essi comprendono antociani, flavonoli, flavan-3-oli, procianidine, altri flavonoidi, resveratrolo, stilbeni, acidi idrossicinnamici e acidi idrossibenzoici, che insieme determinano il colore, il gusto e le proprietà relative alla salute dei vini. Altri metaboliti, come gli zuccheri e acidi organici alifatici, vengono ignorati perché quantificazione mediante HPLC-MS non è affidabile a causa della matrice di effect e soppressione ionica fenomeni 5. All'interno della gamma polarità selezionata con questo metodo, l'approccio è non mirati in quanto mira a rilevare come molti metaboliti differenti possibili 6.
Metodi trascrittomica che permettono di migliaia di trascrizioni di vite da monitorare simultaneamente sono facilitati dalla disponibilità della completa sequenza del genoma della vite 7,8. metodi trascrittomica I primi a base di high-throughput sequencing cDNA si sono evoluti con l'avvento di sequenziamento di prossima generazione in un insieme di procedure note come tecnologia di RNA-Seq. Questo approccio sta rapidamente diventando il metodo di scelta per gli studi di trascrittomica. Tuttavia, un grande corpo di letteratura basata su microarray, che consentono di migliaia di trascrizioni da quantificare in parallelo per ibridazione, ha accumulato per vite. Infatti, prima di RNA-Seq è diventata una tecnologia mainstream, molte piattaforme di microarray commerciali dedicati erano statisviluppato permettendo vite trascrittoma da ispezionare in grande dettaglio. Tra la vasta gamma di piattaforme, solo due ammessi genome-wide analisi del trascrittoma 9. La matrice più evoluti consentito l'ibridazione di un massimo di 12 campioni indipendenti su un unico dispositivo, riducendo così i costi di ogni esperimento. I 12 sub-array ciascuno composti 135.000 sonde 60-mer rappresentano 29,549 trascrizioni di vite. Questo dispositivo è stato utilizzato in un gran numero di studi 10-24. Queste due piattaforme sono state ormai fuori produzione, ma un nuovo microarray personalizzato è stato recentemente progettato e rappresenta uno sviluppo più recente in quanto contiene un numero ancora maggiore di sonde che rappresentano ulteriori geni di recente scoperta di vite 25.
I set di dati di grandi dimensioni-vendita prodotti da trascrittomica e metabolomica analisi richiedono metodi statistici per l'analisi dei dati, comprese le tecniche multivariate per determinare le correlazioni tra forma diversas di dati. Le tecniche multivariate più utilizzati sono quelli a base di proiezione, e questi possono essere sorvegliati, come ad esempio analisi delle componenti principali (PCA), o sotto la supervisione, come ad esempio bidirezionale proiezione ortogonale alle strutture latenti analisi discriminante (O2PLS-DA) 26. Il protocollo presentato in questo articolo utilizza PCA per l'analisi dei dati esplorativi e O2PLS-DA per identificare le differenze tra gruppi di campioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo descrive le metabolomica, trascrittomica e protocolli di analisi statistica utilizzate per interpretare il concetto di terroir uva a bacca. Analisi Metabolomica mediante HPLC-ESI-MS è abbastanza sensibile da rilevare un gran numero di metaboliti simultaneamente, ma relativa quantificazione è influenzata dall'effetto matrice e ioni soppressione / miglioramento. Tuttavia, un approccio simile è già stato utilizzato per descrivere la maturazione e appassimento post-raccolta di frutti di bosco Corvina…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work benefited from the networking activities coordinated within the EU-funded COST ACTION FA1106 “An integrated systems approach to determine the developmental mechanisms controlling fleshy fruit quality in tomato and grapevine”. This work was supported by the ‘Completamento del Centro di Genomica Funzionale Vegetale’ project funded by the CARIVERONA Bank Foundation and by the ‘Valorizzazione dei Principali Vitigni Autoctoni Italiani e dei loro Terroir (Vigneto)’ project funded by the Italian Ministry of Agricultural and Forestry Policies. SDS was financed by the Italian Ministry of University and Research FIRB RBFR13GHC5 project “The Epigenomic Plasticity of Grapevine in Genotype per Environment Interactions”.
Materials
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5×2.1mm; 5μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150×2.1mm; 3μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | – | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In – One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | – | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | – | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus – 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | – | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
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