Nell'attuale clima di scarsità di risorse, stanno emergendo nuove tecnologie che consentono ai ricercatori di condurre studi in modo più economico, veloce e con maggiore precisione. Qui descriviamo lo sviluppo di un test immunologico multiplex di anticorpi salivari basato su microsfere per misurare l'esposizione umana a più patogeni ambientali contemporaneamente.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Lo sviluppo di un anticorpo salivare Multiplex immunoenzimatico per misurare l'esposizione umana ad agenti patogeni ambientali
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'eziologia e impatti di esposizione umana ad agenti patogeni ambientali sono di grande preoccupazione in tutto il mondo e, quindi, la capacità di valutare efficaci approcci high-throughput di esposizione e le infezioni utilizzando costo sarebbe indispensabile. Questo manoscritto descrive lo sviluppo e l'analisi di un immunodosaggio multiplex bead-based in grado di misurare la presenza di anticorpi nella saliva umana per diversi patogeni contemporaneamente. La saliva è particolarmente interessante in questa applicazione, perché è non invasiva, meno costoso e più facile da raccogliere dal siero. Gli antigeni da patogeni ambientali sono stati accoppiati a microsfere carbossilati (perle) e utilizzati per misurare gli anticorpi in molto piccoli volumi di campioni di saliva umana utilizzando una, saggio soluzione fasi bead-based. Beads sono stati accoppiati con gli antigeni di Campylobacter jejuni, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, norovirus (G e G I.1 II.4) e virus dell'epatite. Per garantire che gli antigeni sono stati sufficientemente accoppiatile perline, l'accoppiamento è stata confermata usando specie-specifici, anticorpi di cattura primario di derivazione animale, seguita da incubazione con biotinilati anti-specie anticorpi di rilevamento secondarie e streptavidina-R-ficoeritrina giornalista (SAPE). Come controllo per misurare legame non specifico, un insieme di sferette è stata trattata in modo identico agli altri tranne che non è stato accoppiato a qualsiasi antigene. Le perle antigene-accoppiati e di controllo sono stati poi incubati con campioni di saliva umana prospetticamente raccolti, misurato su un analizzatore alto rendimento basato sui principi della citometria a flusso, e la presenza di anticorpi ciascun antigene è stata misurata in unità di intensità mediana fluorescenza (MFI) . Questo immunodosaggio multiplex ha una serie di vantaggi, tra cui più dati con meno di esempio; riduzione dei costi e del lavoro; e la possibilità di personalizzare il dosaggio per molti obiettivi di interesse. I risultati indicano che il test immuno-multiplex salivare può essere in grado di individuare esposizioni e infezioni precedenti, che può essere especially utile negli studi di sorveglianza che coinvolgono grandi popolazioni umane.
Introduzione
L'ottantotto per cento delle malattie diarroiche in tutto il mondo è associata con l'esposizione umana ad acqua contaminata, alimenti non sicuri, e scarsa igiene / igiene, causando circa 1,5 milioni di morti, la maggior parte dei quali sono bambini 1. Questa è una delle principali cause di preoccupazione per i funzionari della sanità pubblica e dei responsabili politici. Nel tentativo di indagare le esposizioni e le malattie associate con vie d'acqua ed altri agenti patogeni ambientali, abbiamo sviluppato un test immunologico multiplex per misurare gli anticorpi in campioni umani 2-4. Questo metodo può essere applicato a studi epidem....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
L'approvazione è stata ottenuta dalla Institutional Review Board (IRB # 08-1844, University of North Carolina, Chapel Hill, NC, USA) per la raccolta di campioni di saliva stimolati crevicolare da bagnanti a Boqueron Beach, Porto Rico, come parte degli Stati Uniti Environmental Protection Agency (EPA) nazionale epidemiologici e valutazione ambientale di attività ricreative (neear) acqua Studio 23 per la valutazione di nuoto associato esposizioni e malattie. I soggetti dello studio fornito il consenso informato e sono stati istruiti sull'uso del dispositivo di raccolta della saliva da personale qualificato e imprenditori USEPA. I campioni di saliva s....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Un unico insieme di sferette è stato utilizzato come controllo per misurare il legame non specifico e campione a campione variabilità. Queste perle sono state trattate in maniera identica ai antigene accoppiato perline con l'eccezione che non erano incubate con qualsiasi antigene in fase di accoppiamento. valori di MFI> 500 ottenuti dalle sfere di controllo incubati con tutti i campioni di saliva sono stati rimossi da ulteriori analisi a causa della contaminazione sospetta dal sie.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questi risultati indicano che il metodo immunologico multiplex è utile per discriminare tra campioni di saliva che sono immunopositive o immunonegative. Per determinare immunopositività, un unico punto di cut-off è stato sviluppato calcolando la media più tre deviazioni standard dei log trasformato risposte MFI del controllo perline disaccoppiati testati con tutti i campioni di saliva. Il punto di cut-off concessa la possibilità di valutare l'esposizione e immunoprevalence ad un singolo o più agenti patogeni. Questo.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
L'Environmental Protection Agency degli Stati Uniti attraverso il suo Ufficio di Ricerca e Sviluppo finanziato e gestito la ricerca descritta qui. E 'stato sottoposto a controllo amministrativo dell'Agenzia e approvato per la pubblicazione. La citazione di marchi o prodotti commerciali non costituisce approvazione o raccomandazione per l'uso.
Ringraziamenti
Clarissa Curioso è stata supportata attraverso una nomina al Programma di Partecipazione alla Ricerca presso l'Agenzia per la Protezione dell'Ambiente degli Stati Uniti amministrata dall'Oak Ridge Institute for Science and Education attraverso un accordo interagenzia tra il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti e l'EPA degli Stati Uniti.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Attrezzature e software | |||
| Microcentrifuga | Thermo Electron Corporation | 75002446 Utilizzato per centrifugare campioni | |
| Miscelatore a vortice | VWR | G560 | Utilizzato per miscelare campioni |
| Sonicatore (mini) | Fisher Scientific | 15-337-22 | Utilizzato per separare le perline |
| Pipettatori P10, P20, P100, P1000, 8 ch. | Capp | Vari Ematocitometri | |
| (Linea Luminosa) | Housser Scientific | 3200 | Utilizzato per contare le perle accoppiate |
| Collettore a vuoto multischermo | Millipore | MSVMHTS00 | Utilizzato nelle fasi di lavaggio per rimuovere il surnatante |
| MicroShaker | VWR | 12620-926 | Utilizzato per agitare le perle durante le incubazioni |
| Rack per provette (1,5 ml e 0,5 ml) (assortito) | VWR | 30128-346 | |
| Bilancia | Mettler o altro | Utilizzato per misurare i reagenti di lavaggio per la produzione di tamponi | |
| Dynabead Sample Mixer | Invitrogen | 947-01 | Utilizzato durante la fase di incubazione dell'accoppiamento |
| MatLab (R2014b) | The MathWorks, Inc. | Utilizzato per analizzare i dati di risposta anticorpale | |
| Microsoft Excel 2014 | Microsoft Corporation | Utilizzato per analizzare i dati di risposta anticorpale | |
| Luminex Analyzer con software xPonent 3.1 | Luminex Corporation | LX200-XPON3.1 | Strumento e software utilizzati per eseguire assay |
| Antigens | |||
| GI.1 Virus Norwalk: p-particella | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Ospedale pediatrico di Cincinnati. Conc. finale 5 µg. |
| GII.4 Norovirus VA387: p-particella | Xi Jiang (CCHMC)* | NA | *Cincinnati Children' Hospital. Conc. finale 5 µg. |
| Virus dell'epatite A: concentrato di grado II da coltura cellulare | Meridian Life Sciences | 8505 | Antigene accoppiato a 100 µ g |
| Helicobacter pylori: lisato | Meridian Life Sciences | R14101 | Antigene accoppiato a 25 µ g |
| Toxoplasma gondii: p30 ricombinante (SAG1) | Meridian Life Sciences | R18426 | Antigene accoppiato a 25 µ g |
| Campylobacter jejuni: cellule intere uccise termicamente | KPL | 50-92-93 | Antigene accoppiato a 50 µ < |
| strong>Anticorpi primari | |||
| Anti-Norovirus | CCHMC)* | NA | Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento |
| Anti-epatite A IgG Meridian del topo | Sciences | C65885M | Utilizzato per la conferma |
| dell'accoppiamento Anti-epatite A IgG | Meridian Life Sciences | C65885M | Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento |
| BacTraceAffinity Anticorpo purificato contro Helicobacter pylori | KPL | 01-93-94 | Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento |
| pAb di capra a Toxoplasma gondii | Abcam | Ab23507 | Utilizzato per la conferma |
| dell'accoppiamento BacTrace Goat anti-Campylobacter specie | KPL | 01-92-93 | Utilizzato per la conferma |
| dell'accoppiamentoSecondario Anticorpi | |||
| Biotin-SP-Conjugated AffiniPure Donkey anti-Goat IgG (H+L) | Jackson | 705-065-149 | Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento |
| Biotinilato Rabbit anti-Goat IgG (H+L) | KPL | 16-13-06 | Utilizzato per la conferma dell'accoppiamento |
| Biotinylated Goat anti-Mouse IgG (H+L) | KPL | 16-18-06 | Utilizzato per la conferma |
| dell'accoppiamentoAffinità Anticorpo purificato Biotina marcato capra anti-coniglio IgG (H+L) | KPL | 176-1506 | Utilizzato per l'accoppiamento conferma |
| Materiali di consumo | |||
| 1,5 ml provette per microcentrifuga copolimero | USA Scientific | 1415-2500 | Utilizzato come provette per microcentrifuga a basso legame |
| 10 &; l ricariche per puntali per pipette | BioVentures | 5030050C | |
| 200 µ l ricariche per puntali per pipette | BioVentures | 5030080C | |
| 1.000 µ l ricariche per puntali per pipette | BioVentures | 5130140C | |
| Foglio | di | Utilizzato per mantenere le perle al buio durante le incubazioni | |
| Piastre a pozzetti profondi | VWR | 40002-009 | Utilizzato per diluire campioni di saliva |
| Piastre filtranti multischermo | Millipore | MABVN1250 | Utilizzato per eseguire saggi |
| Sistema di raccolta della saliva Oracol | Malvern Medical Developments Limited | Utilizzato per la raccolta della saliva | |
| Reagenti | |||
| Microsfere carbossilate (perline) | Luminex Corporation | A seconda del set di perline | Gli antigeni sono accoppiati alle microsfere |
| EDC (1-etil-3-[3-dimetilamminopropil] carbodiimmide cloridrato) | Pierce | 77149 o 22980 | Utilizzato nell'attivazione |
| delle perleSulfo-NHS (N-idrossisulfosuccinimide) | Pierce | 24510 | Utilizzato nell'attivazione di perline |
| Steptavidin-R-ficoeritrina (1 mg/ml) | Sonde molecolari | S-866 | Utilizzato come reporter |
| MES (2-[N-Morpholino]acido etansolfonico) | Sigma | M-2933 | Utilizzato per l'accoppiamento |
| Tween-20 (poliossietilenesorbitano monolaurato) | Sigma | P-9416 | Utilizzato nel tampone di lavaggio per rimuovere |
| i tamponi proteici di legame non specifici | |||
| PBS-TBN Blocking/ Buffer di conservazione (PBS, 0,1% BSA, 0,02% Tween-20, 0,05% Azide, pH 7,4)** | Filtrare Sterilizzare e conservare a 4 gradi; C | ||
| PBS, pH 7,4 | Sigma | P-3813 | 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl BSA |
| Sigma | A-7888 | 0,1% (p/v)Tween-20 | |
| Sigma | P-9416 | 0,2% (v/v) | |
| Sodio azide (0,05% azide)** | Sigma | S-8032 | **Attenzione: L'azoturo di sodio è acutamente tossico. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Indossare DPI adeguati. Smaltire secondo le leggi applicabili. |
| MES/Tampone di accoppiamento (0,05 M MES, pH 5,0) | |||
| MES (2-[N-Morpholino]acido etansolfonico) | Sigma | S-3139 | |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Assay Buffer (PBS, 1% BSA, pH 7,4) | Filtra Sterilizza e conserva a 4 gradi; C | ||
| PBS, 1% BSA, pH 7,4 | Sigma | P-3688 | 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1% BSA |
| Activation Buffer (0,1 M NaH2PO4, pH 6,2) | Filtro Sterilizzare e conservare a 4 gradi C | ||
| NaH2PO4 (Fosfato di sodio, monobasico anidro) | Sigma | S-3139 | 0,1 M NaH2PO4 |
| 5 N NaOH | Fisher | SS256-500 | |
| Wash Buffer (PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4) | Filter Sterilizzare e conservare a 4 gradi; C | ||
| PBS, 0,05% Tween-20, pH 7,4 | Sigma | P-3563 | 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,05% TWEEN |
Riferimenti
- Prüss-Üstün, A., Gore, F., Bartram, J. Safer water, better health: costs, benefits and sustainability of interventions to protect and promote health. , World Health Organization. Geneva. (2008).
- Augustine, S., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
