Desenvolvimento de uma colite Modelo Antigen-driven para o Estudo de apresentação de antígenos por células apresentadoras de antígenos às células T
Summary
In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).
Abstract
Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.
Introduction
O intestino é a maior superfície do corpo que é exposta ao ambiente externo. Vastas matrizes de micróbios residentes colonizar o intestino humano para formar a microbiota intestinal (ou microflora). Este é estimado para consistir de até 100 trilhões de células microbianas e constitui um dos habitats bacterianas mais densamente povoadas conhecidos na biologia 1-3. No GIT bactérias colonizar um nicho intestinal onde eles sobreviver e se multiplicar 4. Em troca, a microbiota dota o anfitrião com características funcionais adicionais não codificados em seu genoma 1. Por exemplo a microbiota estimula a proliferação de células epiteliais, produz vitaminas que hospeda não pode produzir por si mesmas, regula o metabolismo e protege contra agentes patogénicos 4-6. Dada esta relação benéfica, alguns autores têm sugerido que os seres humanos são "super-organismos" ou "holobionts", que são uma mistura de genes de bactérias e humanos 7,8. Dado o impacto benéfico da microbiota do hospedeiro (humano), o sistema imunitário do intestino necessita de tolerar micróbios comensais para permitir a sua existência no lúmen, mas também matar os patogénios que invadem a partir do lado luminal 9-11. O sistema imunológico intestinal tem desenvolvido mecanismos para distinguir entre os micróbios luminais inofensivos e potencialmente prejudiciais; No entanto, estes mecanismos ainda não são bem compreendidos 12. Manter a integridade intestinal requer uma homeostase imune fortemente regulada para manter o equilíbrio entre tolerância e imunidade 13. Um desequilíbrio na homeostase imune contribui para a indução de doenças intestinais, tais como doença inflamatória do intestino (IBD) 3,14.
Existem dois principais tipos de DII: doença de Crohn (CD) e colite ulcerativa (UC). Os pacientes com estas doenças geralmente sofrem de sangramento retal, diarréia severa e dor abdominal 15,16. A única causa da DII ainda édesconhecida, mas uma combinação de fatores genéticos, influências ambientais e respostas imunes desreguladas pode ser o evento chave para o desenvolvimento da doença 15.
Modelos animais para IBD têm sido utilizados por mais de 50 anos. Nas últimas décadas foram desenvolvidos novos sistemas modelo IBD para testar as várias hipóteses relativas à patogénese da DII 17,18. O modelo melhor caracterizado de colite crónica é o modelo de transferência de células T que induz perturbações da homeostase de células T 19,20. Este modelo envolve a transferência de células T naive a partir de ratinhos imunocompetentes em hospedeiros que não têm T e as células B (tais como RAG – / – e ratinhos SCID) 16,21. O desenvolvimento da doença neste modelo é monitorizada durante 3-10 semanas por avaliação da presença de diarreia, a redução da actividade física, e perda de peso corporal. Este é assim chamado a síndrome de caquexia 16. Em comparação com os ratos saudáveis do tecido do cólon dos exércitos transplantados é thickeR, mais curtos e mais pesado 16. Utilizando o modelo de transferência de células T, é possível compreender como as diferentes populações de células T pode contribuir para a patogénese do IBD 22. O modelo de transferência de células T não analisar as interacções entre as APCs e as células T no processo da doença de uma forma específica para o antigénio. Demonstrou-se que uma interacção entre as células mielóides e células linfóides pode ser responsável pelo desenvolvimento de inflamação intestinal 23. Embora muitos aspectos de DII foram clarificados, os eventos iniciais que conduzem ao desenvolvimento da doença têm ainda de ser claramente entendido.
Foi demonstrado que na ausência da colite transferência microbiota não pode ser estabelecida 24. Recentemente, várias teorias que sugerem IBD pode ser um resultado de uma resposta imunitária contra bactérias comensais 25. Os autores propuseram também que as bactérias comensais são essenciais para induzir a inflamação no intestino distal26. Em livre de germes (GF) os animais o sistema imunitário do intestino é geralmente deficientes 27,28, mas uma colonização destes ratos com uma mistura de-específica isentos de agentes patogénicos bactérias resulta no desenvolvimento do sistema imunitário intestinal totalmente competente 29. Assim, a microbiota parece ser um elemento chave na patogénese do IBD, ou como um mecanismo que predispõe para ou protege contra o desenvolvimento de inflamação intestinal 30,31. As teorias atuais sugerem que IBD é um resultado de desequilíbrio microbiano, chamado disbiose, em pacientes geneticamente predispostos 32, mas ainda não está claro se a disbiose é a causa ou a consequência da doença 12. Considerando o papel de microorganismos no desenvolvimento de DII, em experiências in vitro mostraram que as células T CD4 + podem ser activadas por APCs pulsadas com bactérias intestinais 33,34.
Além disso, demonstrou-se que os antigénios deespécies bacterianas diferentes comensais, tais como E. coli, Bacteroides, Eubacterium e Proteus, é capaz de activar células T CD4 + 35. Isto indica que a apresentação de antigénios bacterianos de células T é de importância para o desenvolvimento de IBD. Para reduzir a complexidade de múltiplos antigénios derivados pela microflora no processo da doença, de uma estirpe de E. coli foi criada que produz o antigénio OVA. Transferência colite foi induzida por injecção de células T específicas de OVA em RAG – / – de animais colonizado com E. expressam OVA coli.
Este modelo baseia-se em evidências recentes sugerindo que CX 3 CR1 + MPs, um grande subconjunto de células na lâmina do cólon (CLP) 36, estão interagindo com células T CD4 + durante a transferência de colite 37. MPs provar o lúmen intestinal para antígeno particulado, tais como bactérias, usando suas dendrites 36, 38,39. Estudos anterioresdemonstrou que MPs também pode levar até antigénios solúveis, tais como óvulos, introduzidos na intestinal lúmen 40,41. Dada a abundância de CX 3 CR1 + MPs no CLP, é possível que essas células podem provar bactérias luminais e interagir com células T CD4. De imagem confocal de murganhos transplantados com células específicas de OVA T CD4 + colonizadas com E. coli PCP-OVA, mostram que CX 3 CR1 + MPs estão em contacto com células AT-II T CD4 + durante o desenvolvimento de colite conduzido pelo antigénio. Este modelo permite o estudo do processo de apresentação de antigénio entre as APCs e as células intestinais T específicas apenas para determinadas bactérias que expressam os antigénios no lúmen do intestino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tal como acontece com todos os outros modelos, o modelo de colite-driven antigénio descrito acima pode apresentar alguns problemas que o investigador realização da técnica deve estar ciente. Ao injetar o OT-II / Vermelho + CD4 + T CD62L + células nos hospedeiros, o investigador deve ser muito gentil e cuidadosa para inserir a agulha para dentro da cavidade peritoneal. Não fazer isso pode resultar na ruptura do intestino do rato que pode levar à morte ou a administração subcutân…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JHN is supported by the Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).
Materials
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
| Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
| 2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
| Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
| High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
| Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
| Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
| Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
| Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
| DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
| Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
| IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
| Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
| Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
| Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
| Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
| Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
| FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
| Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-19 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
| Percoll (density 1.124 g/ml) | Biochrome | L-6145 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
| Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
| FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
| APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
| FACS Calibur | BD Biosciences | ||
| FCS Express V3 software | DeNovo | ||
| Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
| Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
| Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
| Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
| Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
| mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
| mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
| TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
| EasyWin software | Tecan |
Riferimenti
- Backhed, F., Ley, R. E., Sonnenburg, J. L., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 307, 1915-1920 (2005).
- Cario, E., Podolsky, D. K. Intestinal epithelial TOLLerance versus inTOLLerance of commensals. Mol Immunol. 42, 887-893 (2005).
- Sartor, R. B., Mazmanian, S. K. Intestinal Microbes in Inflammatory Bowel Diseases. Am J Gastroenterol Suppl. 1, 15-21 (2012).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, 859-904 (2010).
- Metges, C. C. Contribution of microbial amino acids to amino acid homeostasis of the host. J Nutr. 130, 1857S-1864S (2000).
- Rossi, M., Amaretti, A., Raimondi, S. Folate production by probiotic bacteria. Nutrients. 3, 118-134 (2011).
- Ley, R. E., Peterson, D. A., Gordon, J. I. Ecological and evolutionary forces shaping microbial diversity in the human intestine. Cell. 124, 837-848 (2006).
- Sleator, R. D. The human superorganism – of microbes and men. Med Hypotheses. 74, 214-215 (2010).
- Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition by the innate immune system. Int Rev Immunol. 30, 16-34 (2011).
- Kumar, H., Kawai, T., Akira, S. Pathogen recognition in the innate immune response. Biochem J. 420, 1-16 (2009).
- Smith, P. M., Garrett, W. S. The gut microbiota and mucosal T cells. Front Microbiol. 2, 111 (2011).
- Fava, F., Danese, S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe?. World J Gastroenterol. 17, 557-566 (2011).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122, 107-118 (2005).
- Muzes, G., Molnar, B., Tulassay, Z., Sipos, F. Changes of the cytokine profile in inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterol. 18, 5848-5861 (2012).
- Koboziev, I., Karlsson, F., Grisham, M. B. Gut-associated lymphoid tissue, T cell trafficking, and chronic intestinal inflammation. Ann N Y Acad Sci. 1207 Suppl. 1207, E86-E93 (2010).
- Ostanin, D. V., et al. T cell transfer model of chronic colitis: concepts, considerations, and tricks of the trade. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G135-G146 (2009).
- Elson, C. O., Sartor, R. B., Tennyson, G. S., Riddell, R. H. Experimental models of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 109, 1344-1367 (1995).
- Boismenu, R., Chen, Y. Insights from mouse models of colitis. J Leukoc Biol. 67, 267-278 (2000).
- Powrie, F., Leach, M. W., Mauze, S., Caddle, L. B., Coffman, R. L. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice. Int Immunol. 5, 1461-1471 (1993).
- Rivera-Nieves, J., et al. Emergence of perianal fistulizing disease in the SAMP1/YitFc mouse, a spontaneous model of chronic ileitis. Gastroenterology. 124, 972-982 (2003).
- Ostanin, D. V., et al. T cell-induced inflammation of the small and large intestine in immunodeficient mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G109-G119 (2006).
- Barnett, M., Fraser, A., O’Connor, M. Animal Models of Colitis: Lessons Learned, and Their Relevance to the Clinic. Ulcerative Colitis – Treatments, Special Populations and the Future. , (2011).
- Reindl, W., Weiss, S., Lehr, H. A., Forster, I. Essential crosstalk between myeloid and lymphoid cells for development of chronic colitis in myeloid-specific signal transducer and activator of transcription 3-deficient mice. Immunology. 120, 19-27 (2007).
- Yoshida, M., et al. CD4 T cells monospecific to ovalbumin produced by Escherichia coli can induce colitis upon transfer to BALB/c and SCID mice. Int Immunol. 13, 1561-1570 (2001).
- Eun, C. S., et al. Induction of bacterial antigen-specific colitis by a simplified human microbiota consortium in gnotobiotic interleukin-10-/- mice. Infect Immun. 82, 2239-2246 (2014).
- Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nat Rev Microbiol. 8, 564-577 (2010).
- Chinen, T., Rudensky, A. Y. The effects of commensal microbiota on immune cell subsets and inflammatory responses. Immunol Rev. 245, 45-55 (2012).
- Dimmitt, R. A., et al. Role of postnatal acquisition of the intestinal microbiome in the early development of immune function. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 51, 262-273 (2010).
- Cebra, J. J., Periwal, S. B., Lee, G., Lee, F., Shroff, K. E. Development and maintenance of the gut-associated lymphoid tissue (GALT): the roles of enteric bacteria and viruses. Dev Immunol. 6, 13-18 (1998).
- Ohkusa, T., Nomura, T., Sato, N. The role of bacterial infection in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Intern Med. 43, 534-539 (2004).
- van Lierop, P. P., Samsom, J. N., Escher, J. C., Nieuwenhuis, E. E. Role of the innate immune system in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 48, 142-151 (2009).
- Kaur, N., Chen, C. C., Luther, J., Kao, J. Y. Intestinal dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut Microbes. 2, 211-216 (2011).
- Trobonjaca, Z., et al. MHC-II-independent CD4+ T cells induce colitis in immunodeficient RAG-/- hosts. J Immunol. 166, 3804-3812 (2001).
- Brimnes, J., Reimann, J., Nissen, M., Claesson, M. Enteric bacterial antigens activate CD4(+) T cells from scid mice with inflammatory bowel disease. Eur J Immunol. 31, 23-31 (2001).
- Cong, Y., et al. CD4+ T cells reactive to enteric bacterial antigens in spontaneously colitic C3H/HeJBir mice: increased T helper cell type 1 response and ability to transfer disease. J Exp Med. 187, 855-864 (1998).
- Niess, J. H., et al. CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance. Science. 307, 254-258 (2005).
- Rossini, V., et al. CX3CR1(+) cells facilitate the activation of CD4 T cells in the colonic lamina propria during antigen-driven colitis. Mucosal Immunol. 7, 533-548 (2014).
- Vallon-Eberhard, A., Landsman, L., Yogev, N., Verrier, B., Jung, S. Transepithelial pathogen uptake into the small intestinal lamina propria. J Immunol. 176, 2465-2469 (2006).
- Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. J Exp Med. 203, 2841-2852 (2006).
- Farache, J., et al. Luminal Bacteria Recruit CD103(+) Dendritic Cells into the Intestinal Epithelium to Sample Bacterial Antigens for Presentation. Immunity. , (2013).
- Farache, J., Zigmond, E., Shakhar, G., Jung, S. Contributions of dendritic cells and macrophages to intestinal homeostasis and immune defense. Immunol Cell Biol. 91, 232-239 (2013).
- Schirmbeck, R., et al. Translation from cryptic reading frames of DNA vaccines generates an extended repertoire of immunogenic, MHC class I-restricted epitopes. J Immunol. 174, 4647-4656 (2005).
- Balestrino, D., et al. Single-cell techniques using chromosomally tagged fluorescent bacteria to study Listeria monocytogenes infection processes. Appl Environ Microbiol. 76, 3625-3636 (2010).
- Ortega-Gonzalez, M., et al. Validation of bovine glycomacropeptide as an intestinal anti-inflammatory nutraceutical in the lymphocyte-transfer model of colitis. Br J Nutr. 111, 1202-1212 (2014).
- Capitan-Canadas, F., et al. Fructooligosaccharides exert intestinal anti-inflammatory activity in the CD4+ CD62L+ T cell transfer model of colitis in C57BL/6J mice. Eur J Nutr. , (2015).
- Salazar-Gonzalez, R. M., et al. CCR6-mediated dendritic cell activation of pathogen-specific T cells in Peyer’s patches. Immunity. 24, 623-632 (2006).
- Niess, J. H., Leithauser, F., Adler, G., Reimann, J. Commensal gut flora drives the expansion of proinflammatory CD4 T cells in the colonic lamina propria under normal and inflammatory conditions. J Immunol. 180, 559-568 (2008).
- Radulovic, K., et al. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential. J Immunol. 188, 2001-2013 (2012).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nat Rev Immunol. 14, 667-685 (2014).
- Manta, C., et al. CX(3)CR1(+) macrophages support IL-22 production by innate lymphoid cells during infection with Citrobacter rodentium. Mucosal Immunol. 6 (3), 177-188 (2013).
- Feng, T., Wang, L., Schoeb, T. R., Elson, C. O., Cong, Y. Microbiota innate stimulation is a prerequisite for T cell spontaneous proliferation and induction of experimental colitis. J Exp Med. 207, 1321-1332 (2010).
- Mazzini, E., Massimiliano, L., Penna, G., Rescigno, M. Oral tolerance can be established via gap junction transfer of fed antigens from CX3CR1(+) macrophages to CD103(+) dendritic cells. Immunity. 40, 248-261 (2014).
- Fitzpatrick, L. R. Novel Pharmacological Approaches for Inflammatory Bowel Disease: Targeting Key Intracellular Pathways and the IL-23/IL-17 Axis. Int J Inflam. 2012, 389404 (2012).
- Danese, S. New therapies for inflammatory bowel disease: from the bench to the bedside. Gut. 61, 918-932 (2012).
