Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l'antigene alle cellule T
Summary
In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).
Abstract
Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.
Introduction
L'intestino è il più grande superficie del corpo che è esposto all'ambiente esterno. array Vaste di microbi residenti colonizzano l'intestino umano per formare il microbiota intestinale (o microflora). Questo è stimato a contenere fino a 100 trilioni di cellule microbiche e costituisce uno degli habitat batteriche più densamente popolate noti in biologia 1-3. Nel GIT batteri colonizzare una nicchia intestinale dove sopravvivono e si moltiplicano 4. In cambio, il microbiota dota l'host con l'aggiunta di caratteristiche funzionali non codificati sul suo genoma 1. Ad esempio il microbiota stimola la proliferazione delle cellule epiteliali, produce vitamine che ospita non possono produrre da soli, regola il metabolismo e protegge contro gli agenti patogeni 4-6. Dato questo rapporto vantaggioso, alcuni autori hanno suggerito che gli esseri umani sono "super-organismi" o "holobionts" che sono un mix di batteri e umane geni 7,8. Dato l'impatto positivo del microbiota sull'host (umana), il sistema immunitario intestinale deve tollerare microbi commensali per consentire la loro esistenza nel lume, ma anche uccidere gli agenti patogeni che invadono dal lato luminale 9-11. Il sistema immunitario intestinale ha messo a punto meccanismi per distinguere tra microbi luminali innocui e potenzialmente nocivi; tuttavia questi meccanismi non sono ancora ben compresi 12. Mantenere l'integrità intestinale richiede un omeostasi immunitaria strettamente regolata per mantenere l'equilibrio tra tolleranza e immunità 13. Uno squilibrio nella omeostasi immunitaria contribuisce alla induzione di malattie intestinali come la malattia infiammatoria intestinale (IBD) 3,14.
Ci sono due principali tipi di IBD: malattia di Crohn (CD) e la colite ulcerosa (UC). I pazienti affetti da queste malattie in genere soffrono di sanguinamento rettale, diarrea grave e dolore addominale 15,16. La singola causa di IBD è ancorasconosciuta, ma una combinazione di fattori genetici, influenze ambientali e le risposte immunitarie sregolati potrebbe essere l'evento chiave per lo sviluppo della malattia 15.
Modelli animali per IBD sono stati utilizzati da oltre 50 anni. Negli ultimi decenni sono stati sviluppati nuovi sistemi modello IBD per testare le varie ipotesi riguardanti la patogenesi delle IBD 17,18. Il modello più caratterizzato di colite cronica è il modello di trasferimento di cellule T che induce rottura dell'omeostasi delle cellule T 19,20. Questo modello prevede il trasferimento di cellule T naive da topi immunocompetenti in host che mancano T e cellule B (come RAG – / – e topi SCID) 16,21. Lo sviluppo della malattia in questo modello è monitorato per 3-10 settimane valutando la presenza di diarrea, ridotta attività fisica, e perdita di peso corporeo. Questo si chiama così la sindrome da deperimento 16. Rispetto al topi sani i tessuti del colon degli eserciti trapiantati è Thicker, più corto e più pesante 16. Utilizzando il modello di trasferimento di cellule T, è possibile comprendere come differenti popolazioni di cellule T possono contribuire alla patogenesi delle IBD 22. Il modello di trasferimento di cellule T non analizza le interazioni tra APC e cellule T nel processo della malattia in modo antigene-specifica. È stato dimostrato che una interazione tra cellule mieloidi e cellule linfoidi potrebbe essere responsabile per lo sviluppo di infiammazione intestinale 23. Anche se molti aspetti della IBD sono stati chiariti, gli eventi iniziali che portano allo sviluppo della malattia devono ancora essere ben compreso.
È stato dimostrato che, in assenza del trasferimento microbioti colite non può essere stabilita 24. Recentemente, diverse teorie suggeriscono che IBD potrebbe essere il risultato di una risposta immunitaria contro batteri commensali 25. Gli autori hanno anche proposto che batteri commensali sono essenziali per indurre infiammazione nell'intestino distale26. In assenza di germi (GF) animali il sistema immunitario intestinale è generalmente compromessa 27,28, ma una colonizzazione di questi topi con una miscela di connessione specifici patogeni batteri risultati nello sviluppo della completamente competente sistema immunitario intestinale 29. Quindi, il microbioti sembra essere un elemento chiave nella patogenesi delle IBD, sia come meccanismo che predispone o protegge contro lo sviluppo di infiammazione intestinale 30,31. Teorie attuali suggeriscono che IBD è il risultato di uno squilibrio microbico, chiamato disbiosi, in pazienti geneticamente predisposti 32, ma non è ancora chiaro se il disbiosi è la causa o la conseguenza della malattia 12. Considerando il ruolo dei microrganismi nello sviluppo di IBD, esperimenti in vitro hanno dimostrato che le cellule T CD4 + possono essere attivati da APC pulsate con batteri intestinali 33,34.
Inoltre, è stato dimostrato che gli antigeni dadiverse specie batteriche commensali, come E. coli, Bacteroides, Eubacterium e Proteus, sono in grado di attivare le cellule T CD4 + 35. Ciò indica che la presentazione di antigeni batterici a cellule T è di importanza per lo sviluppo delle IBD. Per ridurre la complessità di molteplici antigeni derivati dalla microflora nel processo di malattia, un ceppo di E.coli è stato creato che produce l'antigene OVA. Trasferimento colite è stata indotta iniettando cellule T OVA-specifici in RAG – / – animali colonizzato con OVA esprimono E. coli.
Questo modello si basa su recenti prove che suggeriscono che CX 3 CR1 + parlamentari, un importante sottoinsieme di cellule nel colon lamina propria (CLP) 36, interagiscono con le cellule T CD4 + durante il trasferimento colite 37. Parlamentari campione lume intestinale per l'antigene di particelle, come i batteri, usando i loro dendriti 36, 38,39. Studi precedentidimostrato che mp può anche assumere antigeni solubili, come OVA, introdotti nel intestinale lume 40,41. Data l'abbondanza di CX 3 CR1 + parlamentari nel CLP, è possibile che queste cellule possono assaggiare i batteri luminali e interagire con le cellule T CD4. Confocale di topi trapiantati con cellule specifiche per OVA T CD4 + colonizzati con E. coli CFP-OVA, dimostrano che CX 3 CR1 + mp sono in contatto con cella OT-II + T CD4 durante lo sviluppo di colite antigene-indotta. Questo modello permette lo studio del processo di presentazione dell'antigene tra APC intestinali e linfociti T specifici solo per particolari batteri antigene esprimendo nel lume intestinale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come per ogni altro modello, il modello di colite antigene-driven sopra descritto può presentare alcuni problemi che il ricercatore di eseguire la tecnica deve essere a conoscenza. Quando si somministra l'OT-II / cellule Rosso + CD4 + T + CD62L dei padroni di casa, l'investigatore deve essere molto dolce e attento a inserire l'ago nella cavità peritoneale. In caso contrario si può provocare la lacerazione della nell'intestino del topo che potrebbe portare alla morte, o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JHN is supported by the Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).
Materials
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
| Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
| 2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
| Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
| High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
| Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
| Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
| Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
| Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
| DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
| Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
| IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
| Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
| Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
| Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
| Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
| Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
| FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
| Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-19 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
| Percoll (density 1.124 g/ml) | Biochrome | L-6145 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
| Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
| FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
| APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
| FACS Calibur | BD Biosciences | ||
| FCS Express V3 software | DeNovo | ||
| Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
| Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
| Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
| Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
| Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
| mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
| mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
| TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
| EasyWin software | Tecan |
Riferimenti
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