Développement d'un modèle Colite antigène conduit à étudier la présentation des antigènes par les cellules présentatrices d'antigènes aux cellules T
Summary
In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).
Abstract
Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.
Introduction
L'intestin est la plus grande surface du corps qui est exposé à l'environnement extérieur. De vastes réseaux de microbes résidents colonisent l'intestin humain pour former le microbiote intestinal (ou microflore). Ceci est estimé à compter jusqu'à 100 trillions de cellules microbiennes et constitue l' un des habitats bactériens les plus densément peuplées connus en biologie 1-3. Dans le GIT bactéries colonisent une niche intestinale où ils survivent et se multiplient 4. En retour, le microbiote confère à l'hôte avec des caractéristiques fonctionnelles supplémentaires non codées sur son génome 1. Par exemple , le microbiote stimule la prolifération des cellules épithéliales, produit des vitamines qui héberge ne peut pas produire par eux – mêmes, régule le métabolisme et la protège contre les agents pathogènes 4-6. Compte tenu de cette relation bénéfique, certains auteurs ont suggéré que les humains sont des «super-organismes» ou «holobionts» qui sont un mélange de gènes bactériens et humains 7,8. Compte tenu de l'impact bénéfique du microbiote sur le (humain) hôte, le système immunitaire intestinal doit tolérer les microbes commensaux pour permettre leur existence dans la lumière , mais aussi tuer les agents pathogènes qui envahissent de côté luminal 9-11. Le système immunitaire intestinal a développé des mécanismes permettant de distinguer entre les microbes luminal inoffensifs et potentiellement nuisibles; Cependant , ces mécanismes ne sont pas encore bien compris 12. Le maintien de l' intégrité intestinale nécessite une homéostasie immunitaire étroitement régulée pour maintenir l'équilibre entre la tolérance et l' immunité 13. Un déséquilibre dans l' homéostasie immunitaire contribue à l'induction de maladies intestinales telles que les maladies inflammatoires de l' intestin (MICI) 3,14.
Il existe deux grands types de MICI: la maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU). Les patients atteints de ces maladies souffrent généralement de saignements rectaux, des diarrhées sévères et des douleurs abdominales 15,16. La seule cause des MII est encoreinconnue, mais une combinaison de facteurs génétiques, les influences environnementales et les réponses immunitaires dérégulées pourrait être l'événement clé pour le développement de la maladie 15.
Les modèles animaux pour les MII ont été utilisés depuis plus de 50 ans. Au cours des dernières décennies , de nouveaux systèmes modèles MII ont été développés pour tester les différentes hypothèses concernant la pathogenèse des MICI 17,18. Le modèle le mieux caractérisé de la colite chronique est le modèle de transfert de cellules T qui induit une perturbation de l' homéostase des lymphocytes T 19,20. Ce modèle consiste à transférer des cellules T naïves de souris immunocompétentes dans des hôtes qui ne disposent pas T et des lymphocytes B (tels que RAG – / – et les souris SCID) 16,21. Le développement de la maladie dans ce modèle est surveillée pendant 3-10 semaines en évaluant la présence de diarrhée, de l'activité physique réduite et une perte de poids corporel. Il en est ainsi appelée le syndrome de dépérissement 16. Par rapport à la souris en bonne santé le tissu colique des hôtes transplantées est thicker, plus court et plus lourd 16. En utilisant le modèle de transfert de cellule T, il est possible de comprendre comment les différentes populations de cellules T peuvent contribuer à la pathogenèse des MICI 22. Le modèle de transfert de cellule T ne pas analyser les interactions entre les APC et les cellules T dans le processus de la maladie d'une manière spécifique à un antigène. Il a été démontré que l'interaction entre les cellules myéloïdes et des cellules lymphoïdes peut être responsable du développement de l' inflammation intestinale 23. Bien que de nombreux aspects de la MII ont été clarifiées, les premiers événements qui mènent au développement de la maladie doivent encore être clairement compris.
Il a été montré qu'en l'absence de transfert de microbiote colite ne peut être établie 24. Récemment, plusieurs théories suggèrent que l' EIA peut être le résultat d'une réponse immunitaire contre des bactéries commensales 25. Les auteurs ont également proposé que les bactéries commensales sont essentiels pour induire une inflammation dans l'intestin distal26. En germe libre (GF) les animaux du système immunitaire intestinal est généralement altérée 27,28, mais une colonisation de ces souris avec un mélange de libre pathogènes spécifiques-bactéries résultats dans le développement du système immunitaire intestinal entièrement compétente 29. Par conséquent, le microbiote semble être un élément clé dans la pathogenèse des MII, soit comme un mécanisme qui prédispose ou protège contre le développement de l' inflammation intestinale 30,31. Les théories actuelles suggèrent que les MII est un résultat d' un déséquilibre microbien, appelé dysbiose, chez les patients génétiquement prédisposés 32, mais on ne sait pas encore si le dysbiose est la cause ou la conséquence de la maladie 12. Eu égard au rôle des micro – organismes dans le développement des IBD, des expériences in vitro ont montré que les cellules T CD4 + peuvent être activés par des APC puisées avec les bactéries intestinales 33,34.
En outre, il a été montré que les antigènes dedifférentes espèces de bactéries commensales telles que E. coli, Bacteroides, Eubacterium et Proteus, sont capables d'activer les cellules T CD4 + 35. Ceci indique que la présentation des antigènes bactériens à des cellules T est importante pour le développement des IBD. Pour réduire la complexité de plusieurs antigènes dérivés par la microflore dans le processus de maladie, d' une souche de E. coli a été créée qui produit l'antigène OVA. Colite de transfert a été induite par l' injection de cellules T spécifiques de l' OVA dans RAG – / – animaux colonisés par OVA exprimant E. coli.
Ce modèle est basé sur des données récentes suggérant que CX 3 CR1 + députés, un sous – ensemble de cellules majeur dans la lamina propria colique (clp) 36, sont en interaction avec les cellules T CD4 + pendant le transfert colite 37. PM échantillonner la lumière intestinale pour antigène particulaire, comme des bactéries, en utilisant leurs dendrites 36, 38,39. Études précédentesa démontré que les députés peuvent également prendre des antigènes solubles, tels que OVA, introduits dans la lumière intestinale 40,41. Compte tenu de l'abondance de CX 3 CR1 + députés dans le clp, il est possible que ces cellules peuvent goûter les bactéries luminales et d' interagir avec des cellules T CD4. L' imagerie confocale de souris transplantées avec des cellules T CD4 + spécifiques d'OVA colonisés par E. coli CFP-OVA, montrent que CX 3 CR1 + députés sont en contact avec OT-II T CD4 + au cours du développement de la colite entraîné antigène. Ce modèle permet l'étude du processus de présentation de l'antigène entre les APC et les cellules T intestinales spécifiques uniquement pour notamment des bactéries exprimant l'antigène dans la lumière intestinale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme avec tous les autres modèles, le modèle de colite entraîné antigène décrit ci-dessus peut présenter quelques questions que l'enquêteur effectuant la technique doit être au courant. Lors de l' injection du OT-II Les cellules / Red + T CD4 + CD62L + dans les armées, le chercheur doit être très doux et prudent d'insérer l'aiguille dans la cavité péritonéale. Ne pas le faire peut conduire à la déchirure de l'intestin de la souris qui pourrait condu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JHN is supported by the Swiss National Foundation (SNSF 310030_146290).
Materials
| LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244620 | |
| Rotary Shake | Reiss Laborbedarf e. K. | Model 3020 GFL | |
| 2 mm gap couvettes | Peqlab Biotechnologie GmbH | 71-2020 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-100ML | |
| Gene Pulser Xcell system | BioRad Laboratories GmbH | 1652660 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Difco | 244510 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5G | |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797-100ML | |
| High Pure Plasmid Isolation Kit | Roche | 11754777001 | |
| Agarose | Carl Roth GmbH & Co | 3810.1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Glacial acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | |
| Gel chamber | PEQLAB Biotechnology GmbH | 40-0708 | |
| Loading Dye | Thermo Fisher | R0611 | |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher | SM0312 | |
| Ethidium bromide solution | Carl Roth GmbH & Co. KG | 2218.3 | |
| Photo-documentation system | Decon Science Tech GmbH | DeVision G | |
| DNA sequencing | MWG-Biotech GmbH | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom | L182-50 | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | HBO 100 | |
| Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad Laboratories GmbH | 1658005 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Fermentas, St. Leon-Rot, Germany | ||
| IstanBlue Solution | Expedeon, Cambridgeshire, United Kingdom | ||
| Nitrocellulose membrane | Macherey-Nagel GmbH & Co. KG | 741280 | |
| Electro blotter | Biometra GmbH | 846-015-600 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003-25G | |
| Anti-Ovalbumin antibody | Abcam | ab181688 | |
| Anti-rabbit IgG HRP | Sigma-Aldrich | A0545 | |
| Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate | Pierce Biotechnology, Thermo Fischer Scientific Inc | 32132 | |
| Forene | Abbott | 2594.00.00 | |
| FBS | Invitrogen | 10500-064 | |
| Falcon Cell Strainers | Fischer Scientific | 08-771-19 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134-5G | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | |
| CD4+ CD62 L+ T isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-093-227 | |
| MACS LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Feeding Needle 20G | SouthPointe Surgical Supply, Inc | FN-7903 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 1496904 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | 230251 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Collagenase type VIII | Sigma-Aldrich | C-2139 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium | AppliChem | A2044, 9050 | |
| Percoll (density 1.124 g/ml) | Biochrome | L-6145 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 | |
| Mouse BD Fc Block | BD Pharmingen | 553141 | |
| FITC-conjugated mAb binding Vß 5.1, 5.2 | BD Pharmingen | 553189 | |
| APC-conjugated mAb binding CD4 GK1.5 | eBioscience | 17-0041-83 | |
| FACS Calibur | BD Biosciences | ||
| FCS Express V3 software | DeNovo | ||
| Meta scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Zeiss Workstation | Zeiss | LSM 7 | |
| Zeiss ZEM software | Zeiss | v4.2.0.121 | |
| Maxisorp immuno plates | NUNC, Roskilde | 442404 | |
| Streptavidin conjugated alkaline phosphatase | Jackson Immuno Research | 016-050-084 | |
| Alkaline phosphatase substrate 4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate | Sigma-Aldrich | 71768-5G | |
| mAb R4-6A2 | BD Biosciences | 551216 | |
| mAb XMG1.2 | BD Biosciences | 554410 | |
| TECAN microplate-ELISA reader | Tecan | ||
| EasyWin software | Tecan |
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