Gestire le celle di Auditory HEI-OC1
Summary
House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.
Abstract
HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.
Introduction
Casa Ear Institute-organo del Corti 1 (HEI-OC1), le cellule sono derivati dal organo uditivo di un 1,2 topo transgenico. L'incubazione di una cella da questo topo transgenico a 33 ° C / 10% di CO 2 (condizioni permissive) induce l'espressione di un gene che innesca immortalare de-differenziazione e proliferazione accelerata; spostando le cellule a 39 ° C / 5% di CO 2 (condizioni non permissive) determina una diminuzione della proliferazione, differenziazione e, almeno nel caso di HEI-OC1, morte cellulare 2,3.
cellule HEI-OC1 sono stati clonati e caratterizzati nel nostro laboratorio oltre un decennio fa, e studi iniziali hanno indicato che essi esprimono specifici marcatori di cellule ciliate cocleari, come prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina e calmodulina, ma anche i marcatori di supporto cellule come connessina 26 e recettore del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF-R) 2. Pertanto, è stato suggerito che HEI-OC1 potrebbe rappresentare un common progenitore per le cellule sensoriali e di sostegno dell'organo del Corti 2. Studi paralleli fornito una forte evidenza che archetipo farmaci ototossici come cisplatino, gentamicina e streptomicina indotto caspasi-3 attivazione in queste cellule, mentre i farmaci considerati non ototossici, come la penicillina, non 2,3. Pertanto, questa linea cellulare è stata proposta come un sistema in vitro per studiare i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella ototossicità e per lo screening del potenziale ototossicità o otoprotective di nuovi farmaci farmacologici. Si stima che le cellule HEI-OC1 sono stati utilizzati in più di centocinquanta studi pubblicati negli ultimi dieci anni.
Mentre guardando il potenziale effetto pro-apoptotico di diversi farmaci è stato l'obiettivo principale della maggior parte degli studi che coinvolgono questa linea cellulare, altri importanti processi cellulari come autofagia e senescenza hanno appena cominciato ad essere studiato in cellule HEI-OC1 4-7. iona recente studio condotto dal nostro laboratorio 8, abbiamo usato cellule HEI-OC1 per raccogliere un insieme completo di dati relativi a morte cellulare, la sopravvivenza, la proliferazione, senescenza e autofagia indotta da farmaci diversi farmacologici frequentemente utilizzate per la clinica. Abbiamo anche confrontato alcune delle risposte delle cellule HEI-OC1 con quelli da HEK-293 (cellule renali di embrioni umani) e HeLa (cellule epiteliali umane) che ricevono un trattamento identico. I nostri risultati indicano che le cellule HEI-OC1 rispondono alla ciascun farmaco in modo caratteristico, con una dose distintivo e sensibilità dipendente dal tempo per almeno uno dei meccanismi in esame. Abbiamo anche sottolineato che in studio che una corretta interpretazione dei risultati sperimentali richiederà l'esecuzione di studi paralleli con più di una tecnica 8.
In un altro studio abbiamo valutato l'uso di cellule HEI-OC1 per valutare la risposta funzionale di prestin, la proteina del motore delle cellule ciliate esterne cocleari (OHC) 9 </sup>. Abbiamo riportato citometria a flusso e studi di microscopia confocale a scansione laser sul modello di espressione prestin, così come non lineare capacità (NLC) e gli studi di bloccaggio delle cellule-patch di intere cellule HEI-OC1 coltivate a permissiva (P-HEI-OC1) e non permissive (NP-HEI-OC1) condizioni. I nostri risultati indicano che sia espressione prestin e la membrana plasmatica aumento complessivo di localizzazione in un modo dipendente dal tempo in cellule NP-HEI-OC1. È interessante notare, abbiamo anche scoperto che l'aumento di localizzazione prestin a livello della membrana plasmatica delle cellule NP-HEI-OC1 correlata con una diminuzione di Na + K + ATPasi, che translocated dalla membrana plasmatica al citoplasma, senza cambiamenti significativi nell'espressione cellulare totale. Inoltre, abbiamo dimostrato che le cellule P-HEI-OC1 hanno un NLC robusta associata Prestin funzione motoria, che è diminuito quando la densità delle molecole Prestin presenti a livello della membrana plasmatica è aumentata. Complessivamente, questi risultati sostengono fortemente l'utilità della HEI-OC1 le cellule per indagare le proteine uditive.
In questo articolo il video viene descritto come la cultura delle cellule HEI-OC1, perché è comodo da usare cellule in crescita in condizioni permissive (P-HEI-OC1) per gli studi di citotossicità, come valutare il meccanismo / s della citotossicità indotta da farmaci e come per eseguire studi elettrofisiologici (ad esempio, patch-clamp, capacità non lineare (NLC)) per indagare le proprietà funzionali del prestin, il motore molecolare del OHC cocleari.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo rapporto viene descritto come la cultura delle cellule HEI-OC1 e li usiamo per valutare i meccanismi di citotossicità indotta da farmaci e di indagare le proprietà funzionali del prestin, il motore molecolare del cocleare OHC. Le modalità tecniche, tuttavia, sono abbastanza generali da essere facilmente adattato ai diversi studi.
Tutti i protocolli descritti richiedono il corretto uso di tecniche di coltura cellulare consolidate 10. Come con qualsiasi altra linea cell…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.
Materials
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33°C/10% CO2 and other at 39°C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 mL | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 mL | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well,flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white,clear botton | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
Riferimenti
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