Arbeiten mit Auditory HEI-OC1-Zellen
Summary
House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) is one of the few mouse auditory cell lines currently available for research purposes. This protocol describes how to work with HEI-OC1 cells to investigate the cytotoxic effects of pharmacological drugs as well as functional properties of inner ear proteins.
Abstract
HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic drugs, these cells have been used to investigate drug-activated apoptotic pathways, autophagy, senescence, mechanism of cell protection, inflammatory responses, cell differentiation, genetic and epigenetic effects of pharmacological drugs, effects of hypoxia, oxidative and endoplasmic reticulum stress, and expression of molecular channels and receptors. Among other several important markers of cochlear hair cells, HEI-OC1 cells endogenously express prestin, the paradigmatic motor protein of outer hair cells. Thus, they can be very useful to elucidate novel functional aspects of this important auditory protein. HEI-OC1 cells are very robust, and their culture usually does not present big complications. However, they require some special conditions such as avoiding the use of common anti-bacterial cocktails containing streptomycin or other antibiotics as well as incubation at 33 °C to stimulate cell proliferation and incubation at 39 °C to trigger cell differentiation. Here, we describe how to culture HEI-OC1 cells and how to use them in some typical assays, such as cell proliferation, viability, death, autophagy and senescence, as well as how to perform patch-clamp and non-linear capacitance measurements.
Introduction
House Ear Institute-Corti – Organ 1 (HEI-OC1) Zellen werden aus dem Hörorgan einer transgenen Maus 1,2 abgeleitet. Inkubation einer beliebigen Zelle aus dieser transgenen Maus , bei 33 ° C / 10% CO 2 (permissive Bedingungen) induziert die Expression eines Gens , das Immortalisieren Entdifferenzierung und beschleunigter Proliferation auslöst; Bewegen der Zellen auf 39 ° C / 5% CO 2 (nicht-permissive Bedingungen) führen zu einer verminderten Proliferation, Differenzierung und zumindest im Fall von HEI-OC1, Zelltod 2,3.
HEI-OC1-Zellen wurden in unserem Labor vor über einem Jahrzehnt kloniert und charakterisiert, und die anfängliche Studien gezeigt, dass sie spezifische Marker der Cochlea-Haarzellen, wie prestin, Myosin 7a, Atoh1, BDNF, Calbindin und Calmodulin exprimieren, sondern auch Marker der Stütz Zellen wie Connexin 26 und Fibroblasten – Wachstumsfaktor – Rezeptor (FGF-R) 2. Daher wurde vorgeschlagen, dass HEI-OC1 eine commo darstellen könnten Vorläufer für sensorische und Stützzellen des Corti – Organ 2. Parallel Studien lieferten starke Hinweise darauf , dass ototoxic Medikamente wie Cisplatin, Gentamicin und Streptomycin induzierte Caspase-3 – Aktivierung in diesen Zellen archetypischen, während Medikamente als nicht-ototoxische, wie Penicillin, nicht 2,3. Daher wurde diese Zelllinie als ein in vitro – System vorgeschlagen , um die zellulären und molekularen Mechanismen in Ototoxizität beteiligt zu untersuchen , und für das Screening des potentiellen Ototoxizität oder otoprotektiven Eigenschaften neuer pharmakologischer Wirkstoffe. Es wird geschätzt, dass HEI-OC1-Zellen wurden in mehr als einhundertfünfzig Untersuchungen in den letzten zehn Jahren veröffentlicht verwendet.
Während der Suche das Hauptziel der meisten Studien war auf dem Potential pro-apoptotische Wirkung verschiedener Medikamente beteiligt diese Zelllinie, andere wichtige Zellprozesse wie Autophagie und Seneszenz haben gerade erst begonnen 4-7 in HEI-OC1 – Zellen untersucht werden. ichna aktuelle Studie aus unserem Labor 8 verwendeten wir HEI-OC1 – Zellen einen umfassenden Satz von Daten über den Zelltod, Überleben, Proliferation, Seneszenz und durch unterschiedliche pharmakologische Wirkstoffe in der Klinik verwendet häufig induzierten Autophagie zu sammeln. Wir verglichen auch einige der Antworten von HEI-OC1-Zellen mit denen aus HEK-293 (menschliche embryonale Nierenzellen) und HeLa (humane Epithelzellen) Empfangen identische Behandlung. Unsere Ergebnisse zeigten, dass HEI-OC1 Zellen an die jedes Medikament in einer charakteristischen Art und Weise, mit einem unverwechselbaren dosis- und zeitabhängige Empfindlichkeit auf mindestens einer der Mechanismen zu untersuch reagieren. Wir betonten auch in dieser Studie , dass eine korrekte Interpretation der experimentellen Ergebnisse erfordern parallel Studien mit mehr als eine Technik 8 durchgeführt wird .
In einer anderen Studie untersuchten wir die Verwendung von HEI-OC1 – Zellen die funktionelle Reaktion von Prestin, das Motorprotein von Cochlea äußeren Haarzellen (OHC) 9 zu bewerten </sup>. Wir berichteten Durchflusszytometrie und der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie Studien über die Muster von Prestin Ausdruck, sowie nichtlineare Kapazität (NLC) und Ganzzell-Patch-Clamp-Untersuchungen in HEI-OC1-Zellen, die in permissiven (P-HEI-OC1) und nicht permissive (NP-HEI-OC1) Bedingungen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass sowohl die Gesamt prestin Expression und Plasmamembran-Lokalisations Anstieg in einer zeitabhängigen Weise in NP-HEI-OC1-Zellen. Interessanterweise fanden wir auch , dass der Anstieg in prestin Lokalisierung in der Plasmamembran von NP-HEI-OC1 – Zellen mit einer Abnahme korreliert in Na + K + ATPase, welche von der Plasmamembran zum Zytoplasma ohne wesentliche Änderungen in Gesamtzellexpressions transloziert. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass P-HEI-OC1-Zellen haben eine robuste NLC Motorfunktion prestin verbunden, die abnimmt, wenn die Dichte der prestin Moleküle, die an der Plasmamembran erhöht. Insgesamt stark diese Ergebnisse die Nützlichkeit von HEI-OC unterstützen1-Zellen auditorischen Proteine zu untersuchen.
In diesem Video-Artikel beschreiben wir, wie HEI-OC1-Zellen zu Kultur, warum es bequem ist, Zellen zu verwenden, die an der permissiven Bedingungen (P-HEI-OC1) für Zytotoxizitätsuntersuchungen, wie der Mechanismus / s von arzneimittelinduzierten Zytotoxizität zu bewerten und wie elektro~~POS=TRUNC Untersuchungen (zB Patch-clamp, nicht-lineare Kapazität (NLC)) durchzuführen funktionellen Eigenschaften von prestin, der molekularen Motor Cochlea OHCs zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Bericht beschreiben wir, wie sie zur Kultur HEI-OC1-Zellen und verwenden Mechanismen der medikamenteninduzierten Zytotoxizität zu bewerten und funktionellen Eigenschaften von Prestin, der molekulare Motor der Cochlea-OHC zu untersuchen. Die technischen Verfahren sind jedoch allgemein genug, um leicht an verschiedene Studien anzupassen.
Alle Protokolle hier beschrieben sind, erfordern die korrekte Verwendung von gut etablierten Zellkulturtechniken 10. Genau wie bei jedem…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH Grants R01-DC010146 and R01-DC010397. Its content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official view of the National Institutes of Health.
Materials
| HEI-OC1 cells | ALL THE ASSAY KITS, EQUIPMENTS | ||
| Class II Biological Safety cabinet | The Baker Company | Sterilgard III | AND COMPANIES INDICATED IN THE |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810R | PREVIOUS 2 COLUMNS ARE ONLY |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert 25 | EXAMPLES, AND ANY OTHER SIMILAR |
| Waterbath | Stovall | HWB115 | PRODUCT COULD BE USED. |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Two (2) Cell incubators, one at 33°C/10% CO2 and other at 39°C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Cell culture dishes, PS, 100 x 20 mm with vents | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Cell culture dishes , PS, 60 x 15 mm with vents | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar tissue culture flasks 250 mL | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| Cellstar tissue cultur flasks 550 mL | Greiner Bio-One | 660-175 | |
| 6 well cell culture plate, with lid-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Tissue culture plate, 96 well,flat bottom with lid | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96-well white,clear botton | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylene conical tube with cap Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml Polypropylene conical tubes with cap-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7.4 (1X) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0.25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Cell Proliferation Assay Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8091 | |
| BrdU Cell Proliferation Assay Kit | Cell Signaling | 6813 | |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G8741 | |
| FACSAriaIII instrument | BD Biosciences | FACSAriaIII | With 488 nm excitation (blue laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Electrophoresis and Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader with Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-clamp amplifier | HEKA | EPC-10 | |
| Puller for preparing patch electrodes | Sutter Instruments | P-97 |
Riferimenti
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