Un Mimic del microambiente tumorale: Un metodo semplice per la generazione di popolazioni di cellule arricchito e Investigating intercellulare Comunicazione

Summary

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Abstract

La comprensione delle prime interazioni eterotipica tra le cellule tumorali e lo stroma non cancerose circostante è importante per chiarire gli eventi che portano all'attivazione stromale e l'istituzione del microambiente tumorale (TME). Diversi in vitro e in vivo della TME sono stati sviluppati; Tuttavia, in generale, questi modelli non facilmente consentono l'isolamento di singole popolazioni cellulari, in condizioni non perturbante, per ulteriori studi. Per aggirare questa difficoltà, abbiamo impiegato un modello TME in vitro utilizzando un substrato di crescita cellulare costituito da un inserto membrana microporosa permeabile che permette semplice generazione di popolazioni cellulari altamente arricchito cresciuto intimamente e separatamente, su entrambi i lati della membrana di inserto per co estesa volte -Culture. Attraverso l'uso di questo modello, siamo in grado di generare notevolmente arricchito fibroblasti cancro-associata (CAF) popolazioni da fibroblasti umani normali diploidi seguenteco-coltura (120 hr) con cellule di carcinoma mammario umano altamente metastatico, senza l'uso di codifica fluorescenti e / o separazione delle cellule. Inoltre, modulando la dimensione dei pori dell'inserto, possiamo controllare il mezzo di comunicazione intercellulare (ad esempio, comunicazione gap-junction, fattori secreti) tra le due popolazioni cellulari eterotipica, che consente studio dei meccanismi alla base dello sviluppo del TME, compreso il ruolo della permeabilità gap-junction. Questo modello serve come un valido strumento per migliorare la nostra comprensione degli eventi iniziali che portano al cancro iniziazione-stroma, la prima evoluzione della TME, e l'effetto modulante dello stroma sulle risposte delle cellule tumorali di agenti terapeutici.

Introduction

Il microambiente tumorale (TME) è un sistema altamente complesso costituito da cellule di carcinoma che coesistono e si evolvono insieme stroma ospite. Questo componente stromale consiste tipicamente di fibroblasti, miofibroblasti, cellule endoteliali, i vari componenti del sistema immunitario, così come una matrice extracellulare ^1. Un costituente significativo, spesso la maggior parte di questo stroma, sono fibroblasti attivati, spesso indicato come fibroblasti cancro-associata o fibroblasti carcinoma-associato (CAF) ^2,3. A differenza dei normali fibroblasti non attivati, CAF contribuiscono iniziazione tumorale, progressione, angiogenesi, invasione, metastasi e recidive ^4-11 in un'ampia varietà di carcinomi, compresi seno, prostata, polmone, pancreas, pelle, colon, esofago, e dell'ovaio ^5,6,12-17. Tuttavia, l'esatta natura del contributo della CAF in tutta patogenesi del cancro rimane scarsamente definita. Inoltre, l'evidenza clinica ha dimostrato un valore prognostico della CAF, Correlando la loro presenza a tumori di alto grado, fallimento della terapia, e la scarsa ^10,18,19 generale la prognosi.

Chiaramente, migliorando la nostra comprensione degli eventi che iniziano nello sviluppo CAF, così come le comunicazioni intercellulari che mediano il loro ruolo all'interno della TME, può fornire nuove interessanti bersagli terapeutici e strategie avanzate che potrebbero migliorare i risultati del paziente. A tale scopo, diversi in vivo e in vitro sono stati sviluppati. Mentre gli approcci in vivo sono più riflessivo di TME dei pazienti, che possiedono limitazioni, tra cui l'immensa complessità ed eterogeneità sia all'interno che tra i tumori. Inoltre, campioni di tumore da soggetti umani spesso rappresentano molto sviluppati TME e non consentono una comprensione degli eventi che iniziano TME. studi su animali sperimentali offrono alcuni vantaggi, tuttavia generalizzazione dei dati sugli animali agli esseri umani dovrebbe essere fatto con cautela a causa delle differenze nei Physiology tra esseri umani e animali come roditori (ad esempio, la chimica tiolo ^20, il tasso metabolico ^21, la tolleranza allo stress ^22, etc.). Inoltre, a differenza della popolazione umana, che è geneticamente eterogenea in natura, gli animali da laboratorio sono in genere allevati per omogeneità. Inoltre, è spesso difficile esaminare variazioni fisiologiche transitorie e cambiamenti fenotipo delle cellule, nonché per il controllo dei parametri sperimentali specifici utilizzando animali come roditori. Così, in vitro 2 e 3 dimensioni (2D e 3D) modelli di coltura dei tessuti sono spesso utilizzati per far progredire la comprensione di base dello sviluppo TME. Nonostante la loro mancanza di una rappresentazione accurata della complessità dei sistemi in vivo, questi modelli offrono vantaggi che facilitano notevolmente indagini meccanicistici. In vitro modelli consentono un'analisi più semplificata, concentrato e conveniente di TME, per cui statisticamente significativa i dati possono essere generati incellule gratuitamente da variazioni sistemici che sorgono in animali.

Ci sono diverse varietà di sistemi in vitro. I due modelli TME in vitro più comunemente utilizzati sono costituiti da monostrato misto o colture cellulari sferoidali. Entrambi i metodi di coltura sono vantaggiose per studi di base di interazioni intercellulari (ad esempio, le cellule normali con cellule tumorali) e per l'analisi di varie modifiche fenotipo cellulare specifici TME (ad esempio, emergere di fibroblasti cancro-associata di fibroblasti normali). Inoltre, gli sferoidi possono creare una struttura di tessuto simile più riflessivo della TME, e possono essere rappresentativi del tumore eterogeneità ^23. Tuttavia sferoidi spesso producono molto diversi gradienti di tensione di ossigeno attraverso i livelli, che possono complicare le conclusioni sperimentali ^24. Purtroppo, entrambi i modelli sono estremamente limitati nella loro capacità di isolare le popolazioni di cellule pure per un'ulteriore caratterizzazione e lo studio dopo cooperazionecultura. Per fare questo è necessario almeno un tipo di cellula di essere fluorescente-tag o etichettati con un produttore di identificazione, e quindi sottoponendo il misto di co-coltura di svariati processi di lavorazione e di smistamento delle cellule per separare le popolazioni di cellule. Mentre un cell sorter è in grado di isolare una popolazione di cellule piuttosto pura, si deve essere consapevoli di stress cellulare e potenziale contaminazione microbica rischi ^25.

Per facilitare la comprensione della comunicazione intercellulare, grandi sforzi sono stati dedicati allo sviluppo e all'ottimizzazione sistemi in vitro che imitano da vicino l'ambiente in vivo, pur consentendo un approccio semplificato. Uno di questi strumenti è l'inserto microporosa permeabile, un substrato di membrana che è stata sviluppata nel 1953 ²⁶ e successivamente adattato per diverse applicazioni e gli studi (per esempio, la polarità delle cellule ^27, endocitosi ^28, il trasporto di droga ^29, la modellazione del tessuto ^30, FertSterilizza- ^31, effetto astante ^32,33, etc.). Questo sistema permette la crescita delle cellule in vivo con -come anatomica e differenziazione funzionale, nonché espressione di molti in vivo marcatori ^34,35 che non si osserva quando coltivate su plasticware impermeabile. Inoltre, l'estremamente sottile membrana porosa (10 micron di spessore) consente la rapida diffusione delle molecole e tempi di equilibrazione, che simula l'ambiente in vivo e permette funzionamento cellulare indipendente in entrambi i domini di cellule apicali e basolaterale. Un ulteriore vantaggio di utilità dell'inserto come sistema TME è la separazione fisica dei due popolazioni cellulari eterotipica coltivati ​​su entrambi i lati della membrana nelle stesse condizioni ambientali, mantenendo diverse modalità di comunicazione intercellulare attraverso i pori della membrana. Anche se fisicamente separati, le due popolazioni cellulari sono metabolicamente accoppiati tramite elementi secreti e, come dedescritto qui, anche attraverso i canali gap-giunzionale. Inoltre, mantenendo gli inserti a in vivo tensione parziale dell'ossigeno (PO _2), il modello riduce le complicazioni di ossigeno e chimiche gradienti osservati in altri sistemi. Piuttosto, aumenta la comprensione dei meccanismi naturali che controllano il TME. In particolare, le due popolazioni cellulari possono essere facilmente isolati con elevata purezza, senza codifica fluorescenti e / o separazione delle cellule dopo periodi prolungati di co-coltura.

Qui si descrive un protocollo in vitro TME costituito da cellule di carcinoma mammario umano e fibroblasti umani coltivati rispettivamente, ai due lati di un inserto membrana microporosa permeabile, ma ancora in continua comunicazione bidirezionale attraverso i pori della membrana. Abbiamo dimostrato che utilizzando membrane con differenti dimensioni dei pori, il contributo di un tipo specifico di comunicazione intercellulare (per esempio, fattori secreti contro giunzioni) allo sviluppodella TME può essere indagato.

Protocol

1. Preparazione della cultura dei media e delle cellule Preparare 500 ml di mezzo di Eagle minimo essenziale integrato con 12,5% (vol / vol) siero bovino fetale inattivato al calore (FBS), 2 mM L-alanil-L-glutammina, e 100 unità di penicillina e 100 pg di streptomicina per ml. NOTA: Il mezzo di crescita e integrazione (s) può essere facilmente scambiato per le esigenze di crescita di altri ceppi cellulari o linee cellulari. Preparare 70 ml di terreno di coltura cellulare per ogni inserto (f…

Representative Results

Qui abbiamo adattato un inserto membrana microporosa permeabile per sviluppare un sistema cellulare di co-coltura heterotypic in vitro che simula il microambiente tumorale in vivo (Figura 1). Questo sistema permette due popolazioni cellulari differenti per essere coltivate su entrambi i lati della membrana porosa-dell'inserto per lunghi periodi di tempo (fino a 120 ore, nel nostro uso). È importante sottolineare che il sistema è in grado di manten…

Discussion

Il protocollo qui descritto è un semplice, adattabile a procedura vitro (Figura 1) che utilizza un inserto membrana microporosa permeabile per generare altamente arricchito popolazioni di cellule individuali di una co-coltura di cellule eterotipica. Significativamente, il modello è adatto per studiare vari modi di comunicazione intercellulare. Le fasi critiche comprendono selezionando l'inserto pori di dimensioni appropriate per specifiche interesse sperimentale (s), seminando la…

Materials

For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line	PerkinElmer	119261	Parental line: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line	Cell Biolabs	AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Sigma	F6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine)	Corning Cellgro	25-015-Cl
Penicillin Streptomycin Solution, 100X	Corning Cellgro	30-002-Cl
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore)	Costar	3450
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore)	Greiner bio-one	657610
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore)	Costar	3452
6-well Culture Plate	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 cell culture flask	CellStar	658 170
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X	Corning Cellgro	21-040-CV	without calcium & magnesium
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X	Corning Cellgro	25-053-Cl
15 mL Centrifuge Tube	CellTreat	229411
35 x 10 mm Cell Culture Dish	Greiner bio-one	627 160
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Immunofluorescent Microscopy
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ Immunofluorescence – 1:5000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ Immunofluorescence – 1:2000
Bovine Serum Albumin – Fraction V	Rockland	BSA-50	Immunoglobulin and protease free
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution	ThermoFisher Scientific	28908	Dilute to 4% with 1X PBS
Premium Cover Glass (22×22 mm No.1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	S36938
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AM	Molecular Probes	C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-076
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot – 1:10000
Tween-20	BioRad	170-6531
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay	BioRad	500-0116
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	BioRad	161-0302
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	161-0158