종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법
Summary
We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.
Abstract
암세포와 주위의 비 – 암성 기질의 초기 이형 작용을 이해하는 것은 실질 활성화 및 종양 미세 환경 (TME) 설립 이어지는 이벤트를 아는데 중요하다. 시험 관내 및 생체 TME 모델 일부는 개발되었다; 그러나, 일반적으로 이러한 모델 용이 추후 연구 비 교란 조건 하에서 각각의 세포군의 분리를 허용하지 않는다. 이러한 어려움을 회피하기 위해 연장 된 공동에 대한 인서트의 멤브레인의 양측에 개별적으로 밀접 성장 고도로 농축 된 세포 집단의 단순 생성하면서도 허용하는 투과성 미다 공막 인서트 이루어진 세포 성장 기판을 이용한 시험 관내 TME 모델을 채용 한 – 문화 회. 이 모델의 사용을 통해, 우리는 정상 이배체 인간 섬유 아세포에서 (CAF) 인구는 다음과 같은 매우 풍부한 암 관련 섬유 아세포를 생성 할 수있다형광 태그 및 / 또는 셀의 정렬을 사용하지 않고 높은 전이성 인간 유방암 세포와 공 배양 (120 시간). 또한, 삽입물의 기공 크기를 조절함으로써, 우리는 개발 근본적인 메커니즘의 조사를 허용하는 두 개의 이형 세포 집단 사이 간 통신 (예를 들어, 갭 정션 통신 분비 인자)의 모드에 대해 제어 할 수있다 갭 접합 투과성의 역할을 포함 TME. 이 모델은 암 기질 개시의 TME의 초기 진화 및 치료제에 대한 암세포의 반응에 기질의 조절 효과로 이어지는 초기 사건에 대한 우리의 이해를 높이는 데 유용한 도구 역할을한다.
Introduction
종양 미세 환경 (TME)을 공존 기질 및 호스트와 함께 진화 암종 세포로 구성된 복잡한 시스템이다. 이 기질 성분은 일반적으로 섬유 아세포, 근육 섬유 모세포, 내피 세포, 다양한 면역 성분뿐만 아니라, 세포 외 매트릭스 (1)로 구성된다. 중요한 성분이 기질의 대부분은 종종 활성 섬유 아세포 자주 암 관련 아세포 또는 암 – 관련 아세포 (CAF) 2,3-라고 칭한다. 정상적인 비 – 활성화 된 섬유 아세포와 달리 CAFs에 유방, 전립선, 폐, 췌장, 피부, 결장, 식도를 포함한 암의 다양한에서 종양의 개시, 진행, 혈관 형성, 침윤, 전이 및 재발 4-11에 기여하고, 5,6,12-17 난소. 그러나, 암 발병에 걸쳐 CAFs에의 기여의 정확한 특성을 제대로 정의 된 상태로 유지됩니다. 또한, 임상 적 증거는 CAFs에의 예후 값을 보여 주었다높은 등급의 악성 종양, 치료 실패 및 전반적인 불량한 예후의 10,18,19에 자신의 존재의 상관 관계.
분명히, CAF 개발 개시 이벤트뿐만 아니라 TME 내 역할을 매개 세포 간 통신에 대한 이해를 향상 환자 결과를 향상시킬 수있는 새롭고 흥미로운 치료 대상 향상된 전략을 제공 할 수있다. 이 목표를 향해, 생체 내 및 생체 외 모델에서 여러 가지가 개발되어왔다. 생체 내 방법은 환자의 TME 더 반사하지만, 그들은 내 종양 사이에 모두 엄청난 복잡성과 이질성을 포함한 한계를 가지고있다. 또한, 피험자의 종양 샘플은 종종 매우 TME 개발 대표하고 TME 개시 이벤트에 대한 이해를 허용하지 않는다. 실험 동물 연구 때문에 그 풍모의 차이 그러나 인간에게 동물 데이터의 일반화가주의해야합니다 몇 가지 장점을 제공합니다같은 설치류 (예를 들어, 티올 화학 (20), 신진 대사 속도 (21), 관용 등, (22)을 강조하는)와 같은 인간과 동물 사이의 ology. 또한, 자연의 유전자 유형이있는 인구는 달리, 실험 동물은 일반적으로 동질성을 사육하고 있습니다. 또한, 일시적인 생리 학적 변화 및 세포 표현형의 변화를 조사 할뿐만 아니라 설치류 동물을 사용하는 실험의 특정 매개 변수를 제어하는 것이 곤란하다. 따라서, 체외 2- 및 3- 차원 (2D 및 3D) 조직 배양 모델에서 자주 TME 개발의 기본적인 이해를 전진하는 데에 이용된다. 생체 시스템의 복잡성을 정확하게 묘사의 부족에도 불구하고, 이러한 모델은 매우 기계적 조사를 용이 장점을 제공한다. 관내 모델은 TME보다 단순화 집중하고 비용 효과적인 분석을 위해, 이에 유의 허용 데이터가 생성 될 수있다동물에서 발생하는 전신 변동이없는 세포.
체외 시스템의 여러 종류가 있습니다. 두 개의 가장 일반적으로 사용되는 TME 체외 모델은 혼합 단층 또는 회전 타원체 세포 배양으로 구성되어 있습니다. 두 배양 방법은 세포 간 상호 작용과 각종 TME 특정 세포 표현형 변화를 분석 (종양 세포 예를 들어, 정상 세포)의 기초 연구에 유리하다 (예를 들면, 정상 섬유 아세포에서 암과 관련된 섬유 아세포의 출현). 또한, 구 상체는 TME보다 반사 형 조직 구조를 만들 수 있고, 종양 이질성 (23)을 대표 할 수있다. 그러나 타원체는 종종 실험의 결론 (24)를 복잡하게 할 수있다 층에 걸쳐 매우 다양한 산소 장력 구배를 생산하고 있습니다. 불행하게도, 두 모델은 매우 코 아래의 추가 특성화 및 연구를위한 순수한 세포 집단을 분리하는 능력에 제한이문화. 이렇게 형광 태그 또는 머신 식별 표지 한 후 세포 집단을 분리 정렬 광범위한 프로세싱 셀에 공 배양을 행하여 혼합되도록 적어도 하나의 세포 유형을 필요로 할 수있다. 셀 소터는 다소 순수한 세포 집단을 분리 할 수 있지만, 하나는 세포 스트레스 및 전위 미생물 오염을 인식 25 위험이어야한다.
간 통신의 이해를 용이하게하기 위해 많은 노력과 개발 간략화 된 방식을 허용하면서 밀접 생체 내 환경을 모방 한 시험 관내 시스템에서 최적화 향해 헌신되었다. 그러한 도구는 투과성 미다 삽입, 제 1953 26 개발이어서 다양한 애플리케이션 및 연구 (예를 들어, 셀의 극성 (27), 엔도 시토 시스 (28), 약물 수송 29 티슈 모델링 30 FERT 적응 된 막 기판ilization 31 방관자 효과 32, 33 등). 이 시스템은 불 침투성 plasticware에 때 배양 관찰되지 않은 34, 35 마커 생체 내에서 많은 사람들의 생체 -like 해부학 적 및 기능적 분화와 세포의 성장뿐만 아니라 표현을 허용한다. 또한, 매우 얇은 다공질 막 (10 μm의 두께)의 생체 내 환경을 시뮬레이트 모두 꼭대기 및 기저 세포 영역에서 독립적으로 세포 기능을 허용 분자 평형 시간의 신속한 확산을 허용한다. 멤브레인의 기공을 통해 간 다양한 통신 모드를 유지하면서 TME 시스템으로 삽입 효용의 추가적인 장점은 동일한 환경 조건에서 멤브레인의 양측 상에 성장 개의 이형 세포 집단의 물리적 분리된다. 비록 물리적으로 분리 된 두 세포 집단은 대사 드로 분비 소자를 통해 접속되며또한 갭 접합부 채널을 통해, 여기 스크라이브. 또한, 생체 부분 산소 장력의 인서트 (PO 2)를 유지함으로써,이 모델은 다른 시스템들에서 관찰 된 산소와 화학 구배의 합병증을 감소시킨다. 오히려, 그것은 자연 TME 제어 메커니즘에 대한 이해를 증가시킨다. 특히, 두 세포 집단 쉽게 공 배양 장기간 다음 형광 태그 및 / 또는 세포 소팅 않고 고순도로 분리 할 수있다.
여기서 우리는 멤브레인 기공을 통해 지속적인 양방향 통신 아직 인간 유방암 세포 투과성 미다 공막 인서트의 양쪽에 각각 자란 인간 섬유 아세포 이루어지는 관내 TME 프로토콜을 설명하지만. 우리는 그 표시 발달로 다양한 기공 크기와 간 통신의 특정 유형의 기여 (간극 연접 비교 예 분비 인자) 막을 사용하여TME으로 조사 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜은 투과성 미다 공막 인서트 이형 세포의 공 배양에서 고농축 개별 세포 집단을 생성하기 위해 이용하는 간단한 시험 관내 절차에 적응 (도 1)이다. 현저하게, 간 모델은 다양한 통신 방식을 연구하기에 적합하다. 중요한 단계는 상단 측에 제 세포군 시드 50 % FBS로 보충 된 배지에서 인서트의 바닥면에 상기 제 세포군 시드 특정 실험이자 (S)에 적절한 기?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the New Jersey Commission on Cancer Research (Pre-Doctoral Fellowship DFHS13PPCO17), the National Institutes of Health (CA049062), and the National Aeronautics and Space Administration (NNX15AD62G).
Materials
| For Cell Culture | |||
| AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast | Coriell | 107661 | Passage 8-13 |
| MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line | PerkinElmer | 119261 | Parental line: ATCC (#HTB-26) |
| MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line | Cell Biolabs | AKR-201 | |
| Eagle's minimal essential medium (MEM) | Corning Cellgro | 15-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Sigma | F6178-500mL | |
| Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine) | Corning Cellgro | 25-015-Cl | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning Cellgro | 30-002-Cl | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore) | Costar | 3450 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore) | Greiner bio-one | 657610 | |
| Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore) | Costar | 3452 | |
| 6-well Culture Plate | Greiner Bio-One Cellstar | 657160-01 | |
| 75 cm2 cell culture flask | CellStar | 658 170 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X | Corning Cellgro | 21-040-CV | without calcium & magnesium |
| 0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X | Corning Cellgro | 25-053-Cl | |
| 15 mL Centrifuge Tube | CellTreat | 229411 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Dish | Greiner bio-one | 627 160 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Immunofluorescent Microscopy | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | In situ Immunofluorescence – 1:5000 |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11029 | In situ Immunofluorescence – 1:2000 |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Rockland | BSA-50 | Immunoglobulin and protease free |
| 16% (wt/vol) Formaldehyde Solution | ThermoFisher Scientific | 28908 | Dilute to 4% with 1X PBS |
| Premium Cover Glass (22×22 mm No.1) | Fisher | 12548B | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-50ML | |
| SlowFade Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | S36938 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Flow Cytometric Analysis | |||
| Calcein, AM | Molecular Probes | C3100MP | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-076 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| For Western Blot Analysis | |||
| Mouse anti-Caveolin 1 | BD Transduction Laboratories | 610406 | Western Blot – 1:10000 |
| Tween-20 | BioRad | 170-6531 | |
| Nitrocellulose Membrane (0.2 μm) | BioRad | 162-0112 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| BioRad DC Protein Assay | BioRad | 500-0116 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | BioRad | 161-0302 | |
| Sodium deoxycholate monohydrate (DOC) | Sigma | D5670 | |
| IGEPAL CA-630 (NP40) | Sigma | I8896 | |
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | BioRad | 161-0158 |
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