A Mimic do microambiente do tumor: um método simples para geração de populações celulares enriquecidas e Investigando intercelular Comunicação

Summary

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Abstract

Compreender as interações heterotípicos precoces entre células cancerosas e torno estroma não-cancerosas é importante para elucidar os acontecimentos que levaram à activação do estroma e estabelecimento do microambiente do tumor (TME). Vários in vitro e em modelos in vivo de o TME foram desenvolvidos; No entanto, em geral, estes modelos não prontamente permitir o isolamento de populações de células individuais, sob condições não perturbando, para um estudo mais aprofundado. Para contornar esta dificuldade, temos utilizado um modelo TME in vitro utilizando um substrato de crescimento de células que consiste de uma inserção da membrana microporosa permeável que permite a geração simples de populações de células altamente enriquecido crescido intimamente, mas separadamente, em cada lado da membrana da pastilha para co prolongado vezes -Cultura. Através da utilização deste modelo, são capazes de gerar fibroblastos associados ao câncer grandemente enriquecido (CAF) populações de fibroblastos humanos diplóides normais seguinteco-cultura (120 h) com células de carcinoma da mama humano altamente metastáticas, sem o uso de marcação fluorescente e / ou separação de células. Além disso, através da modulação do tamanho de poro da pastilha, que podem controlar o modo de comunicação intercelular (por exemplo, comunicação GAP-junção, factores segregados) entre as duas populações de células heterotípicas, que permite a investigação dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do TME, incluindo o papel da permeabilidade gap-junction. Este modelo serve como uma ferramenta valiosa para melhorar a nossa compreensão dos eventos iniciais que conduzem à iniciação do cancro de estroma, o começo da evolução da TME, e o efeito modulador do estroma das respostas de células de cancro a agentes terapêuticos.

Introduction

O microambiente do tumor (TME) é um sistema altamente complexa composta de células de carcinoma que co-existem e evoluem paralelamente estroma hospedeiro. Este componente do estroma consiste tipicamente em fibroblastos, células endoteliais, miofibroblastos, vários componentes do sistema imunológico, bem como uma matriz extracelular ^1. Um componente significativo, muitas vezes a maioria do presente estroma, são fibroblastos activados, frequentemente referido como fibroblastos associados ao cancro ou fibroblastos associada a carcinoma (CAF) ^2,3. Ao contrário de fibroblastos normais, não activado, FAC contribuir para a iniciação do tumor, progressão, angiogénese, invasão, metástase, e recorrência ^4-11 em uma grande variedade de carcinomas, incluindo os da mama, da próstata, do pulmão, pâncreas, pele, cólon, do esófago, e ovário ^5,6,12-17. No entanto, a natureza exata da contribuição da FAC em todo patogênese do câncer permanece mal definida. Além disso, a evidência clínica demonstrou valor prognóstico da FAC, Correlacionando sua presença para malignidades de alto grau, falha terapêutica e pobres ^10,18,19 geral prognóstico.

Claramente, aumentando a nossa compreensão dos eventos que iniciam no desenvolvimento CAF, bem como as comunicações intercelulares mediadoras seu papel dentro da TME, pode fornecer excitantes novos alvos terapêuticos e estratégias avançadas que poderiam melhorar os resultados dos pacientes. Para atingir este objetivo, vários in vivo e in vitro modelos têm sido desenvolvidos. Embora as abordagens in vivo são mais um reflexo do TME dos pacientes, eles possuem limitações, incluindo a imensa complexidade e heterogeneidade, tanto dentro como entre tumores. Além disso, as amostras de tumores de seres humanos representam muitas vezes altamente desenvolvida TME e não permitir uma compreensão dos eventos iniciadores TME. estudos experimentais em animais oferecer algumas vantagens, no entanto generalização dos dados obtidos com animais para os seres humanos devem ser feitas com cautela devido a diferenças na physilogia entre os seres humanos e animais, tais como roedores (por exemplo, tiol química ^20, a taxa metabólica ^{21, 22} da tolerância à pressão, etc). Além disso, ao contrário da população humana, que é geneticamente de natureza heterogénea, animais de laboratório são tipicamente produzidos até à homogeneidade. Além disso, é muitas vezes difícil de examinar as variações e alterações fisiológicas transientes fenótipo celular, bem como para controlar parâmetros experimentais específicos que utilizam animais, tais como roedores. Assim, in vitro 2 e 3 dimensões (2D e 3D) modelos de cultura de tecidos são frequentemente utilizados para fazer avançar a compreensão básica do desenvolvimento TME. Apesar de sua falta de um retrato fiel da complexidade dos sistemas in vivo, estes modelos oferecem vantagens que facilitam muito investigações mecanicistas. Modelos in vitro permitem uma análise mais simplificada, focado, e cost-effective da TME, em que estatisticamente significativa os dados podem ser gerados emcélulas livres de variações sistêmicas que surgem em animais.

Existem diversas variedades de sistemas in vitro. Os dois modelos in vitro TME mais vulgarmente utilizados consistem em monocamada mista ou culturas de células esferóides. Ambos os métodos de cultura são vantajosos para estudos básicos de interacções intercelulares (por exemplo, células normais com as células tumorais) e para a análise de várias alterações de fenótipo celular específico TME (por exemplo, aparecimento de fibroblastos associados ao cancro a partir de fibroblastos normais). Além disso, os esferóides são capazes de criar uma estrutura de tecido semelhante a mais reflexiva da TME, e pode ser representativa da heterogeneidade do tumor ^23. No entanto esferóides muitas vezes produzem muito diferentes gradientes de tensão de oxigênio através de camadas, que podem complicar conclusões experimentais ^24. Infelizmente, ambos os modelos são extremamente limitados na sua capacidade de isolar populações de células puras para posterior caracterização e estudo seguinte co-cultura. Para isso seria necessário pelo menos um tipo de célula a ser fluorescente-etiquetados ou rotulados com uma máquina de identificação e, em seguida, submeter o co-cultura mista à extensa processamento e separação de células para separar as populações de células. Enquanto um classificador de células é capaz de isolar uma população de células em vez puro, deve-se estar ciente do estresse celular e contaminação microbiana riscos potenciais ^25.

Para facilitar a compreensão da comunicação intercelular, grandes esforços têm sido dedicados para o desenvolvimento e optimização de sistemas in vitro que imitam de perto o ambiente in vivo, permitindo ao mesmo tempo uma abordagem simplificada. Uma dessas ferramentas é a inserção microporosa permeável, um substrato de membrana que foi desenvolvido pela primeira vez em 1953 ²⁶ e posteriormente adaptado para diversas aplicações e estudos (por exemplo, polaridade celular ^27, endocitose ^28, o transporte da droga ^29, modelagem ^de tecido ^30, FERTilization ^31, efeito espectador ^32,33, etc). Este sistema permite o crescimento de células in vivo com anatómica -like e diferenciação funcional, bem como a expressão de muitos marcadores in vivo ^34,35 que não são observados quando cultivadas em utensílios de plástico impermeável. Além disso, a membrana porosa extremamente fina (10 um de espessura) permite a rápida difusão de moléculas e tempos de equilíbrio, o qual simula o ambiente in vivo e permite funcionamento celular independente em ambos os domínios celulares basolaterais e apicais. Uma vantagem adicional da utilidade da pastilha como um sistema TME é a sua separação física das duas populações de células cultivadas heterotípicas em ambos os lados da membrana nas mesmas condições ambientais, mantendo ao mesmo tempo vários modos de comunicação intercelular através dos poros da membrana. Embora fisicamente separadas, as duas populações de células metabolicamente são acoplados através de elementos e segregadas, como odescrito aqui, também através de canais GAP-juncional. Além disso, mantendo as inserções em in vivo tensão parcial de oxigénio (pO _2), o modelo reduz as complicações de gradientes de oxigénio e químicos observados em outros sistemas. Pelo contrário, ela aumenta a compreensão dos mecanismos naturais que controlam o TME. Notavelmente, as duas populações de células pode ser facilmente isolado com elevado grau de pureza, sem a marcação fluorescente e / ou separação de células após períodos prolongados de co-cultura.

Aqui, descrevemos um protocolo TME in vitro que consiste de células de carcinoma da mama humano e fibroblastos humanos cultivados, respectivamente, em ambos os lados de uma inserção da membrana microporosa permeável, mas ainda em comunicação bidireccional contínua através dos poros da membrana. Mostra-se que, utilizando membranas com diferentes tamanhos de poros, a contribuição de um tipo específico de comunicação intercelular (por exemplo, factores segregados contra as junções de hiato) para o desenvolvimentodo TME pode ser investigada.

Protocol

1. Preparação de Meios de Cultura e Células Preparar 500 ml de meio de Eagle mínimo essencial, suplementado com 12,5% (vol / vol) de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS), 2 mM de L-alanil-L-glutamina, e 100 unidades de penicilina e 100 ug de estreptomicina por ml. NOTA: O meio de crescimento e suplemento (s) podem ser facilmente trocados para as necessidades de crescimento de outras estirpes de células ou linhas celulares. Preparar 70 ul de meio de cultura de células para ca…

Representative Results

Aqui nós adaptamos uma inserção de membrana microporosa permeável ao desenvolvimento de um sistema de co-cultura de células heterotípica in vitro que simula o microambiente do tumor in vivo (Figura 1). Este sistema permite a duas diferentes populações de células a serem cultivadas em ambos os lados da membrana porosa da inserção por longos períodos de tempo (até 120 horas, em nosso uso). É importante salientar o sistema é capaz de manter …

Discussion

O protocolo aqui descrito é um método simples, adaptável no procedimento in vitro (Figura 1) que utiliza uma inserção de membrana microporosa permeável para gerar populações de células individuais altamente enriquecidas a partir de uma co-cultura de células heterotípicas. Significativamente, o modelo é apropriado para a investigação de vários modos de comunicação intercelular. Os passos críticos incluem seleccionando a inserção de tamanho de poro apropriado para o i…

Materials

For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line	PerkinElmer	119261	Parental line: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line	Cell Biolabs	AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Sigma	F6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine)	Corning Cellgro	25-015-Cl
Penicillin Streptomycin Solution, 100X	Corning Cellgro	30-002-Cl
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore)	Costar	3450
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore)	Greiner bio-one	657610
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore)	Costar	3452
6-well Culture Plate	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 cell culture flask	CellStar	658 170
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X	Corning Cellgro	21-040-CV	without calcium & magnesium
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X	Corning Cellgro	25-053-Cl
15 mL Centrifuge Tube	CellTreat	229411
35 x 10 mm Cell Culture Dish	Greiner bio-one	627 160
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Immunofluorescent Microscopy
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ Immunofluorescence – 1:5000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ Immunofluorescence – 1:2000
Bovine Serum Albumin – Fraction V	Rockland	BSA-50	Immunoglobulin and protease free
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution	ThermoFisher Scientific	28908	Dilute to 4% with 1X PBS
Premium Cover Glass (22×22 mm No.1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	S36938
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AM	Molecular Probes	C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-076
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot – 1:10000
Tween-20	BioRad	170-6531
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay	BioRad	500-0116
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	BioRad	161-0302
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	161-0158