En Mimic av tumören mikromiljö: En enkel metod för att generera anrikade cellpopulationer och undersöka kommunikationen mellan

Summary

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

Abstract

Att förstå de tidiga hetero samspelet mellan cancerceller och den omgivande godartade stroma är viktigt att belysa de händelser som ledde till stromal aktivering och etablering av tumören mikro (TME). Flera in vitro och in vivo-modeller av TME har utvecklats; men i allmänhet är dessa modeller inte lätt tillåter isolering av enskilda cellpopulationer, under icke-störande förhållanden, för vidare studier. För att kringgå denna svårighet, har vi använt ett in vitro-TME modell med användning av en celltillväxtsubstrat bestående av ett permeabelt mikroporöst membran insert som medger enkel generering av höggradigt anrikade cellpopulationer odlas intimt, men separat, på vardera sidan av insatsen membran för utökad co -kultur gånger. Genom användning av denna modell, vi kan generera berikat cancer-associerade fibroblaster (CAF) populationer från normala diploida humana fibroblaster eftersamodling (120 h) med mycket metastatiska humana bröstkarcinomceller, utan användning av fluorescerande märkning och / eller cellsortering. Dessutom, genom att modulera porstorlek av insatsen, kan vi kontrollera för läget för kommunikationen mellan (t.ex. gap-junction kommunikation, utsöndrade faktorer) mellan de två heterocellpopulationer, som medger undersökning av mekanismerna bakom utvecklingen av TME även betydelsen av gap-junction permeabilitet. Denna modell fungerar som ett värdefullt verktyg för att öka vår förståelse av de inledande händelser som leder till cancer-stroma initiering, den tidiga utvecklingen av TME och modulerande effekten av stroma på svaren från cancerceller till terapeutiska medel.

Introduction

Tumören mikro (TME) är ett mycket komplext system bestående av cancerceller som samexistera och utvecklas tillsammans med värd stroma. Detta stromal komponent består typiskt av fibroblaster, myofibroblaster, endotelceller, olika immun komponenter, samt en extracellulärmatrix ^en. En betydande beståndsdel, ofta majoriteten av stroma, aktiveras fibroblaster, ofta kallad cancerassocierade fibroblaster eller karcinom-associerade fibroblaster (CAF) ^2,3. Till skillnad från normala, icke-aktiverade fibroblaster, CAFS bidra till tumör initiering, progression, angiogenes, invasion, metastas, och återkommande ^4-11 i en mängd olika karcinom, inklusive bröst, prostata, lunga, pankreas, hud, kolon, matstrupe, och äggstock ^5,6,12-17. Men den exakta naturen av bidraget från CAFS hela cancer patogenes förblir dåligt definierad. Dessutom har kliniska bevis visat ett prognostiskt värde av CAFS, Korrelera sin närvaro till höggradig maligniteter, terapisvikt, och övergripande dålig prognos ^10,18,19.

Tydligt, öka vår förståelse av de inledande händelser i CAF utveckling, liksom de inter kommunikation som förmedlar sin roll inom TME, kan ge spännande nya terapeutiska mål och förbättrade strategier som skulle kunna förbättra behandlingsresultat. Mot detta mål, flera in vivo och in vitro-modeller har utvecklats. Medan in vivo metoder är mer reflekterande av patienternas TME, de har begränsningar, bland annat den enorma komplexitet och heterogenitet både inom och mellan tumörer. Dessutom tumörprover från försökspersoner ofta representerar högt utvecklade TME och inte tillåter en förståelse för TME initierande händelser. Experimentella djurstudier har vissa fördelar, men generalisering av djurdata till människor bör göras med försiktighet på grund av skillnader i physiology mellan människa och djur, såsom gnagare (t ex, tiol kemi ^20, ämnesomsättning ^21, tolerans att betona ^22, etc.). Vidare, till skillnad från den mänskliga befolkningen, som är genetiskt heterogen till sin natur, laboratoriedjur vanligtvis föds till homogenitet. Dessutom är det ofta svårt att undersöka transienta fysiologiska variationer och cellfenotyp förändringar, liksom att kontrollera för specifika experimentella parametrar som använder djur som gnagare. Således, in vitro 2- och 3-dimensionella (2D och 3D) vävnadsodlingsmodeller ofta utnyttjas för att främja grundläggande förståelse för TME utveckling. Trots sin brist på en rättvisande bild av komplexiteten i in vivo-system, dessa modeller erbjuder fördelar som kraftigt underlättar mekanistiska undersökningar. In vitro-modeller möjliggör en enklare, fokuserad och kostnadseffektiv analys av TME, varvid statistiskt signifikant data som kan genereras iceller fria från systemvariationer som uppstår i djur.

Det finns flera varianter av in vitro-system. De två vanligaste TME in vitro-modeller består av blandade enkelskikt eller sfäroida cellkulturer. Båda odlingsmetoder är fördelaktiga för grundläggande studier av intercellulära interaktioner (t.ex. normala celler med tumörceller) och för analys av olika TME specifika förändringar cell fenotyp (t.ex. uppkomsten av cancerassocierade fibroblaster från normala fibroblaster). Dessutom sfäroiderna kan skapa en mer reflekterande vävnadsliknande struktur av TME, och kan vara representativa för tumör heterogenitet ^23. Men sfäroider producerar ofta mycket varierande syrespännings gradienter över lager, vilket kan komplicera experimentella slutsatser ^24. Tyvärr är båda modellerna ytterst begränsade i sin förmåga att isolera rena cellpopulationer för ytterligare karakterisering och studie efter samarbetekultur. Att göra så skulle kräva åtminstone en celltyp att vara fluorescerande-taggade eller märkta med ett identifierande maker, och sedan utsätta den blandade sam-kultur till omfattande bearbetning och cellsortering för att separera cellpopulationer. Medan en cellsorterare är i stånd att isolera en ganska ren cellpopulation, måste man vara medveten om cellulär stress och eventuella mikrobiella kontamineringsrisker ^25.

För att underlätta förståelsen av intercellulär kommunikation, har stora ansträngningar ägnats åt att utveckla och optimera in vitro-system som nära efterliknar in vivo miljö, medan den tillåter en förenklad metod. Ett sådant verktyg är det genomsläppliga mikro insatsen, en membransubstrat som först utvecklades 1953 ²⁶ och därefter anpassas för olika tillämpningar och studier (t.ex. cell polaritet ²⁷ endocytos ²⁸ läkemedelstransport ^29, vävnadsmodellering ^30, FERTsering ^31, kringstående effekten ^32,33, etc.). Detta system gör det möjligt att tillväxten av celler med in vivo-liknande anatomisk och funktionell differentiering, liksom uttryck av många in vivo markörer ^34,35 som inte observeras när de odlas på ett ogenomträngligt plasten. Dessutom extremt tunna porösa membran (10 ^ m tjock) tillåter snabb diffusion av molekyler och jämviktstider, som simulerar in vivo miljö och tillåter oberoende cellulär funktion på både de apikala och basolaterala cell domäner. En ytterligare fördel med insatsens användbarhet som ett TME system är dess fysikalisk separation av två heterotypiska cellpopulationer som odlats på vardera sidan av membranet i samma miljöförhållanden, under upprätthållande av olika former av intercellulär kommunikation genom membranporerna. Men fysiskt separerade, är de två cellpopulationer metaboliskt kopplad via utsöndrade element och, såsom debeskrivs här, också genom gap-Junktional kanaler. Dessutom, genom att upprätthålla skären vid in vivo partiell syrespänning (PO _2), reducerar modellen komplikationerna av syre- och kemiska gradienter som observerats i andra system. Snarare ökar förståelsen för naturliga mekanismer som styr TME. Särskilt kan de två cellpopulationer enkelt isoleras med hög renhet, utan fluorescerande märkning och / eller cellsortering efter längre perioder av samodling.

Här beskriver vi en in vitro-TME-protokollet består av human bröstkarcinomceller och humana fibroblaster odlas, respektive, på ömse sidor om ett permeabelt mikroporöst membran insatsen, men ändå i en kontinuerlig dubbelriktad kommunikation genom membranporerna. Vi visar att genom att använda membran med olika porstorlekar, bidraget från en viss typ av kommunikationen mellan (t.ex. utsöndrade faktorer kontra gap junctions) till utvecklingav TME kan undersökas.

Protocol

1. Beredning av odlingsmedia och celler Bereda 500 ml av Eagles minimala essentiella medium kompletterat med 12,5% (vol / vol) värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-alanyl-L-glutamin och 100 enheter penicillin och 100 | ig streptomycin per ml. OBS: tillväxtmedium och supplement (er) kan lätt bytas ut mot tillväxtkrav andra cellstammar eller cellinjer. Förbered 70 ul av cellodlingsmedium för varje insats (6-brunnsformat infoga): Eagles minimala essentiella medium komplettera…

Representative Results

Här har vi anpassat ett permeabelt mikroporöst membran insats för att utveckla ett in vitro hetero cell co-kultursystem som härmar in vivo tumörmikro (Figur 1). Detta system möjliggör för två olika cellpopulationer som skall odlas på vardera sidan om insatsens porösa-membran under längre tidsperioder (upp till 120 h, i vår användning). Viktigare systemet är i stånd att bibehålla renheten hos de cellpopulationer, såsom bestämt genom ut…

Discussion

Protokollet som beskrivs här är en enkel, anpassningsbar in vitro förfarande (figur 1) som utnyttjar ett genomträngligt mikroporöst membran insatsen generera höganrikat individuella cellpopulationer från en samodling av hetero celler. Betecknande nog är modellen lämpar sig för att undersöka olika typer av intercellulär kommunikation. De kritiska stegen inkluderar att välja den lämpliga porstorlek insatsen för specifik experimentell intresse (s), sådd den första cellpopulationen…

Materials

For Cell Culture
AG01522 (i.e., AG1522) human diploid fibroblast	Coriell	107661	Passage 8-13
MDA-MB-231-luc-D3H1 breast adenocarcinoma cell line	PerkinElmer	119261	Parental line: ATCC (#HTB-26)
MDA-MB-231/GFP breast adenocarcinoma cell line	Cell Biolabs	AKR-201
Eagle's minimal essential medium (MEM)	Corning Cellgro	15-010-CV
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified	Sigma	F6178-500mL
Corning Glutagro Supplement (200mM L-alanyl-L-glutamine)	Corning Cellgro	25-015-Cl
Penicillin Streptomycin Solution, 100X	Corning Cellgro	30-002-Cl
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (0.4 μm pore)	Costar	3450
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (1 μm pore)	Greiner bio-one	657610
Transwell Insert (i.e., permeable microporous membrane insert) (3 μm pore)	Costar	3452
6-well Culture Plate	Greiner Bio-One Cellstar	657160-01
75 cm2 cell culture flask	CellStar	658 170
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1X	Corning Cellgro	21-040-CV	without calcium & magnesium
0.25% (vol/vol) Trypsin, 2.21 mM EDTA, 1X	Corning Cellgro	25-053-Cl
15 mL Centrifuge Tube	CellTreat	229411
35 x 10 mm Cell Culture Dish	Greiner bio-one	627 160
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Immunofluorescent Microscopy
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	In situ Immunofluorescence – 1:5000
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	ThermoFisher Scientific	A-11029	In situ Immunofluorescence – 1:2000
Bovine Serum Albumin – Fraction V	Rockland	BSA-50	Immunoglobulin and protease free
16% (wt/vol) Formaldehyde Solution	ThermoFisher Scientific	28908	Dilute to 4% with 1X PBS
Premium Cover Glass (22×22 mm No.1)	Fisher	12548B
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
SlowFade Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	S36938
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Flow Cytometric Analysis
Calcein, AM	Molecular Probes	C3100MP
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-076
Name	Company	Catalog Number	Comments
For Western Blot Analysis
Mouse anti-Caveolin 1	BD Transduction Laboratories	610406	Western Blot – 1:10000
Tween-20	BioRad	170-6531
Nitrocellulose Membrane (0.2 μm)	BioRad	162-0112
Western Lightning Plus-ECL	PerkinElmer	NEL104001EA
BioRad DC Protein Assay	BioRad	500-0116
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	BioRad	161-0302
Sodium deoxycholate monohydrate (DOC)	Sigma	D5670
IGEPAL CA-630 (NP40)	Sigma	I8896
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	BioRad	161-0158