הסינתזה של RGD פונקציונלית הידרוג ככלי יישומים טיפוליים

Summary

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

Abstract

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.

The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

Introduction

הידרוג הן רשתות תלת מימדי נוצר על ידי פולימרים צולבים הידרופילי, אשר הם טבעיים או סינתטיים, ואת המאופיינת במבנה תלת מימדי ייחודי. מכשירים אלו אטרקטיביים יותר ויותר בתחומי הביו-הרפואיים של אספקת סמים, הנדסת רקמות, נושאות גנים ^1,2 חיישנים חכמים. אכן, תכולת המים הגבוהה שלהם, כמו גם המאפיינים rheological המכאניים שלהם להפוך אותם מועמדים מתאימים לחקות microenvironments רקמות רך ולגרום להם כלים יעילים ציטוקינים מסיסים במים או מסירת גורם גדילה. אחד לשימוש המבטיח ביותר הוא בתור ביולוגי בזריקות נושאת תאי תרכובות ביו. הידרוג עשוי לשפר הישרדות תא ואת גורלו תאי גזע מלא על ידי החזקה ודווקא מתן אותות רגולטוריות תאי גזע באופן רלוונטי פיסיולוגי, כפי שנצפה במבחנה בניסויי vivo ^3,4. היתרון המוביל של זה הוא האפשרותכדי לשמור על תאים מוזרקים בתוך האזור של חיסון (in situ), הפחתת כמות התאים שמשאירה את שטח extravasates לתוך מבול הדם, נודד בכל רחבי הגוף ואיבוד יעד המטרה ^5. היציבות של רשתות הידרוג'ל תלת ממדי נובעת מאתרי cross-linking שלה, שהוקמו על ידי קשרים קוולנטיים או כוחות משיכה בין שרשרות הפולימר ^6.

במסגרת זו, כימיה סלקטיבית מאונכת להחיל שרשרות פולימר הוא כלי תכליתי מסוגל לשפר את הביצועים הידרוג'ל ^7. ואכן, השינוי של פולימרים עם קבוצות כימיות מתאימות יכול לעזור לספק כימי מתאים, פיזי תכונות מכאניות לשפר כדאיויות תא והשימוש בם היווצרות רקמה. באותו אופן, בין הטכניקות לטעון תאים או גורמי גדילה בתוך מטריצת ג'ל, השימוש של פפטיד RGD מאפשר שיפורי הידבקות תא והישרדות. RGD הוא tripeptide מורכבשל ארגינין, גליצין וחומצה אספרטית, שהוא בלי ספק היעיל ביותר, ולעתים קרובות מועסקי tripeptide בשל יכולתה לטפל יותר קולטן הידבקות תא אחד וההשפעה הביולוגית שלה על עיגון תא, התנהגות והישרדות ^8,9. בעבודה זו, הסינתזה של הידרוג הפונקציונלית RGD נלמדת במטרה בעיצוב הרשתות מאופיינות תכונות הביוכימיות מספיק עבור microenvironment תא מסבירי פנים.

שימוש קרינת מיקרוגל בסינתזה הידרוג'ל מציע הליך פשוט כדי למזער תגובות לוואי ולקבל שיעורי תגובה גבוהים ותשואות בתוך פרק זמן קצר יותר לעומת התהליכים התרמיים הקונבנציונליים ^10. שיטה זו אינה דורשת צעדים טיהור והתשואות הידרוג'ל סטרילית בשל אינטראקציות של פולימרים והיעדר ממיס אורגני במערכת התגובה ^11. לכן, היא מבטיחה באחוזים גבוהים של RGD צמוד רשת הפולימרים כי אף modifications נדרש הקבוצות הכימיות פולימר המעורבים ביצירת ג'ל. קבוצות carboxyl, מן PAA ו carbomer, וקבוצות הידרוקסיל, מ PEG ו agarose, להצמיח את המבנה התלת-ממדי הידרוג'ל באמצעות תגובה polycondensation. הפולימרים ציינו משמשים לסינתזה של הידרוג בטיפולים תיקון פגיעה בחוט השדרה ^12. התקנים אלה, כפי שדווח קודם עובד ^13,14, להראות התאמה ביולוגית גבוהה, כמו גם תכונות מכניות physicochemical הדומים לאלו של רקמות חיות רבות בטבע thixotropic. יתר על כן, הם נשארים מקומי באתרו, על אזור ההזרקה.

בעבודה זו, קבוצות carboxyl PAA הם שונים עם מחצית אלקין (איור 1), וכן תרכובת RGD-יזיד הוא מסונתזת ניצול תגובתיות של קבוצת מסוף tripeptide -NH ₂ עם תרכובת כימית מוכנה עם מבנה (CH _{2) n} – N ₃ (<strong> איור 2). כתוצאה מכך, PAA השונה מגיב עם נגזר RGD-יזיד הקלקה CuAAC התגובה ^15-17 (איור 3). שימוש זרז נחושת (I) מוביל לשיפורים משמעותיים בשני קצב התגובה ואת רגיוסלקטיביות. התגובה CuAAC נעשה שימוש נרחב סינתזה אורגנית ב מדע הפולימרים. הוא משלב יעילות גבוהה וסובלנות גבוהה הקבוצות הפונקציונליות, וזה מושפע שימוש בממסים אורגניים. סלקטיביות גבוהה, זמן תגובה מהיר הליך טיהור פשוט לאפשר הקניית פולימרי כוכב, קופולימרים לחסום או שרשרות השתלת moieties רצוי ^18. האסטרטגיה לחץ זה מאפשר לשנות פולימרים לאחר פילמור להתאים אישית את מאפייני physicochemical בהתאם ליישום ביוכימיים הסופי. תנאי ניסוי CuAAC הם לשחזור בקלות (התגובה היא לא רגישה למים, ואילו חמצון נחושת עלול להתרחש מינימאלי), והמהותtriazole נוצר מבטיח יציבות של המוצר. השימוש מתכת נחושת יכול להיחשב נקודה קריטית, עקב השפעה רעילה הפוטנציאל שלה נגד תאים והן במיקרו-סביבה ביולוגית, אבל דיאליזה משמש כשיטה טיהור כדי לאפשר פינוי מוחלט של שאריות קטליטי. לבסוף, PAA שונה RGD משמש סינתזה הידרוג'ל (איור 4) ואת מאפייני physicochemical של רשתות וכתוצאה נחקרות, על מנת לבדוק את הפונקציונליות הפוטנציאל של מערכות אלה כנשאים תאים או סמים.

איור 1: PAA שונה סינתזה אלקין סכימה של functionalization PAA עם קבוצת אלקין;. "n" מציין את מונומרים עם קבוצת carboxyl מגיבים עם propargylamine. אנא לחץ כאן לצפייהגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2:.. סינתזה-יזיד RGD הסינתזה של נגזרי RGD-יזידו אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: לחץ תגובת תכנית תגובה קליק בין נגזרת RGD-יזיד ו-PAA אלקין.. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: הידרוג'ל synthesis. הליך סינתזת הידרוג'ל פונקציונלי RGD. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Protocol

הערה: כימיקלים המשמשים כפי שהתקבלו. לינארית RGD נרכש, אבל זה יכול להיות מוכן על ידי סינתזה פפטיד שלב מוצק רגיל Fmoc 16,19. ממסים של כיתת אנליטי. הדיאליזה מחייבת שימוש קרום עם M w חתוך שווה 3,500 Da. התרכובות המסונתזות מאופייני 1 ספקטרום NMR H ונרשם על כלורופורם באמ?…

Representative Results

נגזר אלקין PAA הוא מסונתז ביעילות מחומצת polyacrylic ו propargylamine, כפי הראה באיור 1 כאשר n תוויות את מונומרים אשר קבוצות carboxyl מגיבים עם אמין. זהות המוצר אושר על ידי 1 ספקטרוסקופיה H-NMR. איור 5 מראה 1 ספקטרום H-NMR של PAA שונה עם אג"ח משולש. <p class="jove_…

Discussion

The PAA post-polymerization modification with alkyne moieties and the RGD functionalization with the azide group guarantee the formation of a stable bond between the polymer and the peptide. Indeed, triazole serves as a rigid linking unit among the carbon atoms, attached to the 1,4 positions of the 1,2,3-triazole ring and it cannot be cleaved hydrolytically or otherwise. In addition, triazole is extremely difficult to oxidize and reduce, unlike other cyclic structures such as benzenoids and related aromatic heterocycles<…

Materials

Poly(acrylic acid) solution average Mw ~ 100,000, 35 wt % in H2O	Sigma Aldrich	523925	CAS 9003-01-4
Poly(ethylene glycol) 2,000	Sigma Aldrich	84797	CAS 25322-68-3
Carbomeer 974P	Fagron	1387083
Agarose	Invitrogen Corp.	16500-500	UltraPure Agarose
RGD peptide	abcam	ab142698
4-azidobutanoic acid	Aurum Pharmatech	Z-2421	CAS 54447-68-6
Oxalyl chloride	Sigma Aldrich	O8801	CAS 79-37-8
Propargylamine hydrochloride 95%	Sigma Aldrich	P50919	CAS 15430-52-1
Copper(I) iodide	Sigma Aldrich	3140	CAS 7681-65-4
Sodium ascorbate	Sigma Aldrich	Y0000039	CAS 134-03-2
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417
Dialysis Membrane	Spectrum Laboratories, Inc.	132725	Spectra/Por 3 Dialysis Membrane  Standard RC Tubing                      MWCO: 3,5 kD