We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.
Den microfluidic probe (MFP) letter å utføre lokal kjemi på biologiske substrater ved å avgrense nanoliter mengder væsker. Ved hjelp av en spesiell implementering av MFP, den hierarkiske hydrodynamisk strømningsbegrensnings (hHFC), er flere væsker samtidig bringes i kontakt med et substrat. Lokal kjemiske handling og flytende forme bruker hHFC, utnyttes til å skape celle mønstre ved lokalt lysering og fjerning av celler. Ved å benytte søkemulighetene på MFP, er brukerdefinerte mønstre av cellemonolagene opprettet. Denne protokollen muliggjør rask, i sanntid og romlig styrt mønstring celle, noe som kan tillate selektiv celle-celle og celle-matriks-interaksjonsstudier.
I sitt opprinnelige miljø, celler i biologisk vev oppfatter en rekke biokjemiske og fysiske signaler regissere sin vekst, organisasjon og utvikling. Forstå disse stikkordene krever selektiv undersøkelse av celle-celle og celle-matrise interaksjoner. Dette nødvendiggjør utvikling av metoder for mønster cellemonolagene. Metoder for å geometrisk separate ulike celletyper i kultur (mønster) gjør brede studier av fysiske og kjemiske signaler i cellebiologi. De fleste av dagens tilnærminger for mønster cellelag 1-4 avhenge deponering celle-adhesjonsproteiner på overflater eller bruker microfabricated sjablonger for selektiv vekst på underlag. I motsetning til dette, her presenterer vi en fremgangsmåte for å raskt mønster cellemonolag in situ, dvs. celler i kultur, ved å fjerne celler som i utvalgte områder av monolaget. Metoder som utfører slike subtraktiv mønstring 5-9 usually krever spesialiserte underlag, overflatebehandling, kompleks operasjon, fysisk kontakt eller ablasjon ved hjelp av en laser, utilsiktet påvirker levende celler. Vi her bruker en microfluidic probe (MFP) 10,11, en ikke-kontakt skanning microfluidic teknologi som hydrodynamisk begrenser en væske på et substrat. En viktig del av multifunksjonsmaskinen er den microfabricated hodet inneholder mikro (figur 1). Den tilhørende plattform består av sprøytepumper for flytende kontroll, scener for skanning av kontroll og en invertert mikroskop for visualisering og feedback (figur 2). I sin grunnleggende konfigurasjon omfatter MFP hode to mikrokanaler med åpninger på toppen, en for injisering av et behandlingsvæske, og den andre for å aspirere den injiserte behandlingsvæsken sammen med noen nedsenking væske (figur 3A). Under drift MFP, er toppunktet i en fast avstand fra substratet. Når aspirasjon strømningshastighet (QA) er sufficiently høyere enn injeksjonsstrømningsmengden (Q-i), dvs. en Q: Q i ≥ 2,5, prosessvæsken er begrenset på substratet. Dette resulterer i en hydrodynamisk strømningsbegrensnings (HFC). Regionen der prosessvæsken er i direkte kontakt med substratet er betegnet fotavtrykk. For typiske driftsforhold, blir strømmen av prosessvæsken inne i HFC kjennetegnet ved et lavt Reynolds tall (Re ≈ 10 -2) og en høy Péclet nummer (Pe ≈ 10 2). Dette innebærer væske strømmer i laminær regime med konveksjon være den primære modusen for masseoverføring av kjemiske arter. De numeriske og analytiske modeller for flyt sperring er beskrevet andre steder 12-14.
I denne artikkelen bruker vi tilnærming til samtidig begrensnings flere behandlings væsker, som kalles hierarkisk HFC (hHFC) 14. Å implementere hHFC med multifunksjonsmaskinen, to additional åpninger er nødvendig for å tilveiebringe en sekundær kilde til injeksjon og aspirasjon. Dette gjør oss i stand til å begrense en væske i en annen væske. De indre (processing) flytende fordeler av å være skjermet fra bortkommen rusk på underlaget ved den ytre (skjerming) væske. I tillegg gir hHFC drift i to modi: (i) den nestede modus, der prosessvæsken i det indre HFC berøring med flaten (figur 3B), og (ii) den klemt modus, der den indre væsken mister kontakt og bare den ytre væsken er i kontakt med substratet (figur 3C). Bytte mellom de to modusene tillater brukere å utføre eller stoppe behandlingen underlaget og oppnås ved å kontrollere hode-til-overflate gap eller ved å endre forholdet mellom injeksjonsstrømmer (Q i2 / Q i1). For en gitt kanal geometri, kan fotavtrykk av prosessvæsken på substratet styres ved å modulere strømningsforhold (figur 3D). Sodium hydroksyd (NaOH) anvendes som den indre prosessvæsken for å lysere cellene, og lysatet blir kontinuerlig suget fra overflaten. Fordi de kjemiske virkningene av prosessvæsken blir lokalisert til den indre HFC fotavtrykk, de tilstøtende cellene forblir uforstyrret, noe som gir tid og rom undersøkelser av celle-celle interaksjoner. Skanne funksjonaliteten til MFP tillater etablering av brukerdefinerte geometrier av cellemønster (figur 4). Videre er valget av NaOH som behandlingsvæske har plass til nedstrøms-DNA-analyse (figur 7).
Vi presenterer en allsidig protokoll for subtraktive mønstring av cellemonolagene som muliggjør hurtig dannelse av romlig definerte cellemønstre. Selektiv oppløsning av cellemonolagene blir utført ved anvendelse av NaOH som prosessvæsken i hHFC. NaOH umiddelbart denatures proteinene som finnes i cellemembranen. Vi anbefaler bruk av 50 mM konsentrasjon av NaOH for å sikre nedstrøms prosessering av lysatet. Denne konsentrasjonen kan økes for raskere fjernelse celle, forutsatt lysat nedstrøms prosessering er ikke et mål. Den hHFC sikrer at ubehandlet omkringliggende områdene av cellemonolaget forblir upåvirket og er tilgjengelig for enten å utvide mønster eller sondering andre egenskaper cellene.
Hastigheten av cellefjerning er en funksjon av både den kjemiske og skjærpresentert av strømningen. Vi velger en rekkevidde på strømningshastigheter å ha kjemi dominerende celle fjerning. Skanning hastigheter på 10-20 & #181; m / sek ved hjelp av en NaOH-injeksjonsstrømningshastighet på 6 – 8 mL / min brukes for å lette "hurtig" subtraktiv mønster. Den raske frekvensen av celle fjerning løser noen utfordringer flattrykk basert mønster tilnærminger 20,21. Disse fremgangsmåter krever en mekanisme for å begrense vekst av celler i romlig definerte områder, for eksempel, ved selektiv avsetning av celle adhesjonsproteiner via mikrokontakttrykking og etterfølgende såing av cellene for å oppnå et mønster. De er begrenset ved lav gjennomstrømning og kreve flere sekvensielle trinn for mønstergenerering, så vel som en ny sjablong / stempel for hvert mønster. Den beskrevne metoden krever ikke selektiv vekst av celler i definerte områder, og overvinner flere begrensninger ved å utføre subtraktiv mønster i motsetning til trykking, mens ikke kreve noen ekstra behandling av cellekulturen substratet.
Med protokollen skissert i denne artikkelen, gjennomstrømningen av mønster cellemonoer økt, mens få umiddelbar visuell tilbakemelding av mønsteret generert. Dette muliggjør sanntids modifikasjon av mønstrene. En slik styring kan være avgjørende i situasjoner hvor cellenes levedyktighet på en gitt overflate er ikke homogent. En annen fordel ved fremgangsmåten er at det samme hode og kjemi kan anvendes for å generere flere mønstre, og dermed redusere antall trinn som er involvert i å generere et mønstret celle monolag.
Dimensjonene på kanalene i hodet og hode geometri kan skaleres i henhold til kravene for programmet, noe som tillater kontroll over oppløsningen av mønster. Alle eksperimenter i nåværende arbeid ble utført ved hjelp av en MFP hode med fast blenderåpning dimensjoner, spesielt med indre åpninger på 100 × 100 mikrometer og ytre åpninger på 200 × 100 mikrometer. Denne utformingen med større ytre åpninger ble valgt for å sikre kontinuerlig drift av hHFC uten tilstopping av åpningene etterStray celleavfall. Vi har testet hoder med indre åpningsdimensjonene 50 × 50 mikrometer og 50 mikrometer avstand mellom dem, med vellykkede resultater i cellen fjerning. Bruk av mindre blenderåpninger, ned til 10 × 10 mm med 10 mm avstand, ville tillate skalering til et mindre fotavtrykk størrelse (~ 30 × 30 mm), og dermed gjør en høyere oppløsning i mønster. Vi observerte driftsproblemer med blender størrelser mindre enn 10 mikrometer grunn av tilstopping fra partikler. På grunn av slike driftsvanskeligheter, er 100 mikrometer det samme som nivået av oppløsningen og dermed en begrensning av den beskrevne teknikk. Men vi kan løse dette ved hjelp av flytende utformingen evne til hHFC. Vi har vist at oppløsningen av cellefjerning kan være innstilt for et gitt sett av åpningsdimensjonene ved å kontrollere Q I2 / Q I1 (figur 4b), og toppunktet-til-substrat gap 10,14. De trinn som benyttes i den aktuelle arbeidet har en minste trinnstørrelse på 100 nm.En kombinasjon av disse kontrollerbare parametre kan forbedre romlig oppløsning av cellefjerning i form av fotavtrykket størrelse og skanning avstand.
Hvis mønstrede ko-kulturer er ønskelig å studere bestemte celle-celleinteraksjoner mellom forskjellige celletyper, kan sekvensiell såing og mønstring bli utført ved hjelp av protokollen beskrevet. Endelig kan forøkbare DNA av høy kvalitet oppnås fra lysatet, slik det fremgår av den snevre topp i DNA smeltekurven (se figur 7). Vi evaluerte en DNA-mengde på ca. 1,6 ng fra en enkelt fotavtrykk (ca. 300 celler) ved anvendelse qPCR, som er nær teoretisk forventning (6-8 pg / celle). Dette indikerer en mengde av det ekstraherte DNA egnet for flere nedstrømsprosesser, mens man unngår bruk av DNA isoleringsmetoder. Dette åpner muligheter for DNA-analyse-baserte lokale sondering av dyrkede celler. Evnen til å forme hHFC væsker kan også brukes for å avsette levende celler og proteiner på activated flater, som i kombinasjon med den subtraktive mønstring og sekvensiell ko-dyrking presentert i denne protokollen muliggjør dannelsen av komplekse celle og celle-matriks-mønster på kultur substrater. Allsidigheten og den styring som tilveiebringes ved hHFC basert subtraktiv mønstring av cellemonolagene og muligheten for å utføre DNA-analyse på de ekstraherte celler, gir et kraftig nytt verktøy satt til biologer å utføre romlig oppløste studier som involverer celle-interaksjoner.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European Research Council (ERC) Starting Grant, under the 7th Framework Program (Project No. 311122, BioProbe). We thank Dr. Julien Autebert and Marcel Buerge for technical assistance and discussions during the development of the protocol and the platform. Prof. Petra Dittrich (ETH Zurich), Prof. Bradley Nelson (ETH Zurich), Dr. Bruno Michel and Dr. Walter Riess are acknowledged for their continuous support.
Materials | |||
Microfluidic Probe (MFP) | NA | NA | Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research – Zürich |
Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers | ThermoFisher scientific, USA | 154461 | 2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm^2 and capable of holding upto 3 ml of media volume |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals and cell lines used | |||
Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B | SigmaAldrich chemicals, USA | S5881, 252859, E9884, R6626 | Chemicals used for processing and shielding liquids |
Proteinase K | Qiagen, Germany | 19131 | protease to digest denatuired proteins |
Deconex 16 Plus | Bohrer Chemie, Switzerland | NA | Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning. |
DNA away | ThermoFisher scientific, USA | 7010 | Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases. |
DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement | ThermoFisher scientific, USA | 10566-016 | Culturing medium for epithelial cells. |
CellTracker Green CMFDA dye | ThermoFisher scientific, USA | C7025 | Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours. |
CellTracker Orange CMRA dye | ThermoFisher scientific, USA | C34551 | |
β-actin genomic primers for qPCR | Integrated DNA technologies, USA | NA | Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR. |
MCF7 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-22 | Cell lines used to produce co-cultures. |
MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-26 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment and fluidic connections | |||
Motorized high precision stages | Custom machined components. Linear axis motors from LANG GmBH, Germany | Customized linear axis stages from LT series | 3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port. |
Syringes | Hamilton, Switzerland | 1700 TLLX series | Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range. |
Nemesys low pressure syringe pumps | cetoni GmbH, Germany | NA | Component of pumping station. |
Circular M1-connector | Dolomite microfluidics, United Kingdom | 3000051 | Interface between vias in MFP head and tubing |
Tilt/rotation stage Goniometer | OptoSigma, USA | KKD-25C | Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex |
DS Fi2 HD color camera (CCD) | Nikon, Switzerland | NA | Controlled using DS-U3 controller unit |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Win – Commander | LANG GmBH, Germany | NA | Stage control software. |
Qmix Elements | cetoni GmbH, Germany | NA | Pump control software. |
NIS Elements | Nikon, Switzerland | NA | Basic research module for image acquisition and analysis. |