توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من<em> كولاي</em>: تصميم وإنتاج وتنقية
Summary
A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.
Abstract
اهتمام متزايد في تطبيق تقنيات البيولوجيا الاصطناعية لبرنامج حويصلات الغشاء الخارجي (OMV) تؤدي إلى بعض التطبيقات مثيرة جدا للاهتمام وفريدة من نوعها لOMV حيث النانوية التقليدية تثبت من الصعب جدا لتجميع. حتى الآن، وقد ثبت عن البكتيريا سالبة الجرام لانتاج أو.ام.في التظاهر التعبئة والتغليف من مجموعة متنوعة من البضائع التي تتضمن جزيئات صغيرة، والببتيدات والبروتينات والمادة الوراثية. وبناء على حمولتها متنوعة، وتورط OMV في العديد من العمليات البيولوجية التي تتراوح بين الاتصالات خلية خلية لنقل الجينات وتسليم عوامل الفوعة اعتمادا عليها البكتيريا تنتج أو.ام.في. إلا في الآونة الأخيرة البكتيرية OMV تكون ميسرة للاستخدام عبر مجموعة واسعة من التطبيقات من خلال تطوير تقنيات لمراقبة والتعبئة والتغليف مباشرة من البروتينات المؤتلف في OMV. يصف هذا البروتوكول وسيلة لإنتاج وتنقية، واستخدام انزيم تعبئتها OMV توفير لتحسين overaإنتاج ليرة لبنانية من انزيم المؤتلف، وزيادة البثور، وتعزيز الاستقرار الانزيم. واستخدام الناجح لهذا البروتوكول يؤدي إلى خلق السلالة البكتيرية التي تنتج في وقت واحد بروتين المؤتلف، وتوجهها لOMV التغليف من خلال استحداث رابط الاصطناعية بين البروتين المؤتلف والخارجي البروتين غشاء مرساة. تفاصيل هذا البروتوكول أيضا طرق لعزل OMV من الثقافات البكتيرية وكذلك التقنيات السليمة للتعامل معها والأشياء في الاعتبار عند التكيف مع هذا البروتوكول للاستخدام في تطبيقات أخرى فريدة من نوعها مثل: تسليم الصيدلانية المخدرات والتشخيص الطبي، وإصلاح البيئة.
Introduction
المقدمة هنا هي طريقة لتصميم وإنتاج وتنقية البكتيرية حويصلات الغشاء الخارجي محملة انزيم (OMV). OMV صغيرة، unilamellar في المقام الأول، proteoliposomes التي تتراوح في حجمها 30-200 نانومتر 1،2. وقد أثبتت جميع البكتيريا سالبة الجرام وموجبة الجرام التي تم دراستها لتاريخ الافراج عنه إما OMV أو الحويصلات خارج الخلية (EV) من سطحها 3،4. آلية دقيقة التي يتم إنتاجها OMV لم يتم بعد توضح تماما بسبب التجمعات البكتيرية المتنوعة التي تفرز لهم، وكذلك الوظائف المختلفة التي تخدمها. وقد ثبت OMV لنقل مجموعة واسعة من البضائع من الجزيئات الصغيرة، والببتيدات والبروتينات والمادة الوراثية تقدم مجموعة متنوعة من الإشارات المعقدة، النبات الجينات، والفوعة تقوم بعملها 5،6.
الآليات الدقيقة لOMV نشوء حيوي لا تتميز بشكل جيد، ويبدو أن تختلف بين الأنواع البكتيرية. وعلى الرغم من ثيالصورة الحقيقة، قمنا بتطوير طريقة لتعزيز كفاءة التعبئة والتغليف من البروتين المؤتلف في OMV عن طريق إنشاء الربط الاصطناعية بين بروتين من الفائدة والبروتين الذاتية وفيرة للغاية لالغشاء الخارجي للبكتيريا ولاحق OMV. في حالة عدم وجود الربط الاصطناعية، أو تقارب إدراجها بشكل مصطنع، بين البروتين المعبر عنه recombinantly وOMV كفاءة التعبئة والتغليف المرصودة منخفضة جدا (7). هذه النتيجة هي التي يمكن توقعها على تضمين البروتينات داخل OMV يحدث إما عن طريق تغليف فرصة عشوائي في نفس اللحظة من تشكيل OMV على سطح البكتيريا أو من خلال التعبئة والتغليف إخراج الآليات التي ليست مفهومة جيدا. وقد لوحظ بعض النجاح في التعبئة والتغليف البروتينات ببساطة من خلال أكثر من التعبير في الفضاء محيط بالجبلة التي تعتمد على تغليف فرصة عشوائي ولكن التعبئة الفعالة هي عالية البروتين تعتمد مع بعض البروتينات التعبئة والتغليف في كفاءة عالية بالمقارنة مع الآخرين عشرفي لا حزمة في كل 8-10. من خلال استخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية المشتركة سعينا لهندسة الإشريكية القولونية (إي كولاي) لإنتاج واحد، حزمة وتفرز انزيم نشط من الاهتمام الى OMV أن تلتف القيود المعرفة الحالية بشأن كيف تتشكل OMV وكيف يتم تحديد البضائع عن طريق البكتيريا ل التعبئة والتغليف.
لأغراض هذا التطبيق تم اختيار نظام البروتين bioconjugation الانقسام كما الربط الاصطناعية من خيار لتسهيل التعبئة والتغليف الاتجاه إلى OMV. وكما يوحي اسمها يتكون نظام البروتين bioconjugation تقسيم اثنين من المجالات فرعية التكميلية التي تتفاعل مع بعضها البعض. ويشار إلى المجالات البروتين الانقسام التي تم اختيارها لأغراض هذا البروتوكول باسم SpyCatcher (SC) وSpyTag (ST) المجال و هي مستمدة من المكورات العقدية المقيحة ملزمة فبرونيكتين البروتين (FbaB) 11. هذا النظام بروتين الانقسام هو غير عادي في أن ثالدجاجة مفارز هما على مقربة سندات isopeptide تشكل بشكل عفوي بين الداني الأسبارتيك بقايا حمض أميني ويسين خلق صلة التساهمية. لا يتطلب تشكيل السندات Isopeptide إضافة البروتينات كوصي، والإنزيمات المحفزة، أو العوامل المساعدة ويمكن أن يحدث بسهولة في درجة حرارة الغرفة (RT) وأكثر من مجموعة واسعة من الشروط ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية 12.
كدليل على المفهوم، وقد تم اختيار phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) من Brevundimonas الضئيلة ليتم تعبئتها في كولاي المستمدة OMV 13. يحتوي PTE على ثنائي النواة الموقع الزنك / الزنك نشط ولديه القدرة على تحطيم الفوسفات العضوية من خلال رد فعل التحلل تحويل aryldialkylphosphates إلى dialkylphosphates والكحول أريل 14. التعرض لالفوسفات العضوية يضعف وظيفة النواقل العصبية السليمة من خلال تثبيط المائي للأستيل كولين قبل أستيل عند التقاطعات العصبية والعضلية ماكينز الفوسفات العضوي المركبات المشتقة خطيرة للغاية (15). لفترات طويلة أو التعرض الكبير لالفوسفات العضوية ينتج عادة في التشنجات لا يمكن السيطرة عليها، وعادة ما يسبب الموت عن طريق الاختناق. في حين PTE يسلك أعلى نشاط الحفاز نحو الباراأكسيون، مبيد حشري قوية جدا، بل هو أيضا قادرة على hydrolyzing مجموعة واسعة من المبيدات الأخرى وV / G نوع غاز الأعصاب الكيميائي 16. لتسهيل OMV التعبئة والتغليف، وقد تم تصميم البلازميد البكتيري أن يشفر بناء الجين الذي يحتوي على المروج محرض، سلسلة توطين محيط بالجبلة، ويبعد مسافة قصيرة متعددة موقع استنساخ المنبع من سلسلة SC الجينات. غرز الجينات PTE بين القائد وتسلسل SC يسمح لخلق التحول الجيني الذي يستهدف تدريب المدرسين-SC الانصهار البروتين إلى الفضاء محيط بالجبلة لOMV التعبئة والتغليف. في حين أن جهود وصفها هنا تركز على تدريب المدرسين، وجين الإنزيم قابلة للتبديل، ويمكن بسهولة أن يتم استبدال مع تسلسل الجينات آخر لبناء واجهاتالتعبئة والتغليف ilitate إنزيم بديل أو البروتين.
وبما أن الجزء الثاني من الربط الاصطناعية، يتم اختيار وفيرة الخارجي بروتين الغشاء (OmpA) لتقديم تسلسل الببتيد ST. في حين أن اختيار البروتين مرساة يمكن أن تختلف، فمن الضروري أن البروتين يحتوي على نطاق المتساهل الذي يطرح داخل الفضاء محيط بالجبلة، تسامح بناء الانصهار دون إحداث السمية الخلوية، ومن المعروف أن تكون موجودة في OMV، ولا تجميع عندما يكون recombinantly أنتجت. OmpA هو 37.2 كيلو دالتون بروتين الغشاء PORIN أن يعرف أن يتم التعبير عنها بشكل كبير في الغشاء الخارجي للبكتيريا ولاحق OMV 17. هو متورط في نقل الجزيئات الصغيرة، <2 نانومتر في الحجم، عبر غشاء البكتيريا (18). مواطن OmpA اثنين من المجالات فريدة من نوعها من الناحية الهيكلية، والغشاء بيتا برميل عزر وجزء للذوبان periplasmically C-محطة معروفة للتفاعل مع ببتيدوغليكان 19. في متحولة OmpA-ST الانصهار المصممد هنا تم حذف الجزء C-محطة من OmpA وتنصهر في ST إلى N- التي تواجه periplasmically أو C-ترميني. حذف جزء محيط بالجبلة من OmpA يقلل من عدد من التفاعلات بين الغشاء الخارجي وببتيدوغليكان مما أدى إلى زعزعة استقرار الغشاء مما يؤدي إلى فرط تحوصل 7. واستمر الجينوم OmpA بالإضافة إلى بناء OmpA-ST أعرب recombinantly للتخفيف الإجمالي زعزعة استقرار الغشاء.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعمل هذا البروتوكول على إثبات وجود ممثل الموجهة تقنية التعبئة والتغليف التي تنتج انزيم من الفائدة وتعبئتها في OMV من قبل كولاي. كما هو الحال مع العديد من التقنيات المعقدة هناك مناطق متعددة في أي بروتوكول يمكن تعديلها لاستيعاب لاستخدامها في تطبيقات فريدة من نوعها…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.
Materials
| IPTG | Any | Always prepare fresh or aliquot and freeze. | |
| L-arabinose | Any | Can be prepared ahead of time and stored at 4C. | |
| Ampicillin | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| Chloramphenicol | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
| TB/LB Culture Media | Any | Other growth medias will likely work similarly. | |
| Triton X-100 | Any | One of many potential suitable surfactants. | |
| Baffled culture flasks | Any | The baffles promote higher levels of aeration. | |
| CHES | Fisher Bioreagents | BP318-100 | Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8). |
| Paraoxon | Chem Service | N-12816 | Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly. |
| Syringe Filter 0.45 µm | Thermo Scientific | 60183-221 (30 mm) | Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical. |
| Shaker incubator | New Brunswick | Excella E24 | Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. |
| Sorvall Culture Centrifuge | Thermo Scientific | RC 5B PLUS | Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g. |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | WX Ultra 90 | Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g. |
| Ultracentrifuge Rotor | Thermo Scientific | AH-629 | Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced. |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced. |
| Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 | Necessary for enzyme kinetic assays. |
| DLS / particle tracking | NanoSight | LM10 | Necessary for OMV size distribution and concentration determination. |
| BL21(DE3) | NEB | Suitable bacterial expression strain. | |
| pET22 | EMD Millipore | 69744-3 | Other plasmids can be used in place of these. |
| pACYC184 | NEB | Other plasmids can be used in place of these. | |
| Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Example kit. |
Riferimenti
- Avila-Calderon, E. D., et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).
- Beveridge, T. Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles. J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).
- Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria. Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).
- Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).
- Berleman, J., Auer, M. The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery. Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).
- Alves, N. J., et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).
- Kim, J. Y., et al. Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality. J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).
- Kesty, N. C., Kuehn, M. J. Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles. J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).
- Zakeri, B., et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).
- Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag. J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).
- Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta. Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).
- Bigley, A. N., Raushel, F. M. Catalytic mechanisms for phosphotriesterases. Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).
- Minton, N. A., Murray, V. S. G. A review of organo-phosphate poisoning. Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).
- Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis. J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).
- Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. Gram-negative bacteria: the cell membranes. Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).
- Wang, Y. The function of OmpA in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).
- Danoff, E. J., Fleming, K. G. The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel. Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).
- Alves, N. J., Kline, J. A. Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).
- Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).
- Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation. Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).
- Alves, N. J., et al. Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP). Analyst. 138, 4746-4751 (2013).
- Mayer, L. D., StOnge, G. Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques. Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).
- Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).
- De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O’Connor-McCourt, M. D. Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding. Biochimica. 42, 1754-1763 (2003).
- Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo. J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).
- Lee, E. Y., et al. Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli. Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles. Sci. Rep. 6, 24866 (2016).
- Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles. Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).
