Neonatal Cardiac Ställningar: Nya Matriser för regenerativ studier

Summary

I dessa studier ger vi metodik för nya, neonatala, murina hjärt ställningar för användning i regenerativa studier.

Abstract

The only definitive therapy for end stage heart failure is orthotopic heart transplantation. Each year, it is estimated that more than 100,000 donor hearts are needed for cardiac transplantation procedures in the United States^1-2. Due to the limited numbers of donors, only approximately 2,400 transplants are performed each year in the U.S.². Numerous approaches, from cell therapy studies to implantation of mechanical assist devices, have been undertaken, either alone or in combination, in an attempt to coax the heart to repair itself or to rest the failing heart³. In spite of these efforts, ventricular assist devices are still largely used for the purpose of bridging to transplantation and the utility of cell therapies, while they hold some curative promise, is still limited to clinical trials. Additionally, direct xenotransplantation has been attempted but success has been limited due to immune rejection. Clearly, another strategy is required to produce additional organs for transplantation and, ideally, these organs would be autologous so as to avoid the complications associated with rejection and lifetime immunosuppression. Decellularization is a process of removing resident cells from tissues to expose the native extracellular matrix (ECM) or scaffold. Perfusion decellularization offers complete preservation of the three dimensional structure of the tissue, while leaving the bulk of the mechanical properties of the tissue intact⁴. These scaffolds can be utilized for repopulation with healthy cells to generate research models and, possibly, much needed organs for transplantation. We have exposed the scaffolds from neonatal mice (P3), known to retain remarkable cardiac regenerative capabilities,^5-8 to detergent mediated decellularization and we repopulated these scaffolds with murine cardiac cells. These studies support the feasibility of engineering a neonatal heart construct. They further allow for the investigation as to whether the ECM of early postnatal hearts may harbor cues that will result in improved recellularization strategies.

Introduction

Hjärtsvikt är vanligt och dödliga. Det är en progressiv sjukdom som resulterar i minskad kontraktilitet av hjärtat, vilket försämrar blodflödet till organ och lämnar de metaboliska kraven från kroppens otillfredsställda. Det uppskattas att 5,7 miljoner amerikaner har hjärtsvikt och det är den främsta orsaken till sjukhusvistelse i USA ^9. Den sammantagna kostnaden för behandling av patienter i hjärtsvikt i USA överstiger $ 300 miljarder dollar per år ^9-10. Den enda definitiva terapi för slutstadiet av hjärtsvikt är orthotopic hjärttransplantation. Varje år uppskattas det att mer än 100.000 givar hjärtan behövs för hjärttransplantationsförfaranden i USA ^1-2. På grund av de begränsade antalet donatorer är endast cirka 2400 transplantationer utförs varje år i USA ^två. Uppenbarligen måste denna organbristen åtgärdas som andra strategier krävs för att producera ytterligare organ för transplantation och helst skulle dessa organ vara autologa för att undvika de komplikationer som är förknippade med avstötning och livstids immunsuppression.

Däggdjur vuxna cardiomyocytes visa en begränsad förnyelseförmåga vid skada men nyligen tyder på att däggdjur neonatala hjärtan upprätthålla en anmärkningsvärd förnyelseförmåga efter skada ^5-8. Speciellt efter partiell kirurgisk resektion, en regenerativ fönster har upptäckts mellan födelse och postnatal dag 7. Denna regenerativa period kännetecknas av en brist på fibrotisk ärr, bildandet av kärlnybildning, frigörande av angiogena faktorer från epikardium och cardiomyocyte spridning ^{5-8 , 11.} Denna regenerativa tidsfönster ger möjlighet till användning av den neonatala hjärt som en ny källa av material för utveckling av en bioartificiell hjärta.

Den extracellulära matrisen är känd för att ge viktiga ledtrådar för att främja cardiomyocyte spridning och tillväxt. Tydliga skillnader i tillgången på molekyler i neonatala och vuxna matriser ¹² och deras förmåga att främja regenerering har undersökts ^13. Decellulariserade vuxna matriser har använts i flera studier för att tillhandahålla en ECM byggnadsställning för cellulär rekolonisering och genereringen av en bioartificiell hjärta. Även om dessa studier, och nya upptäckter inom stamcellsteknik, avancerar snabbt, flera hinder har ännu inte uppfyllt. Till exempel begränsningar i att bevara nativa strukturen av matrisen, cellulära integration i matrisen väggen, och förmåga att stödja spridning och tillväxt all gräns framgången med detta tillvägagångssätt. Medan överlägsna regenerativa egenskaper har tillskrivits den neonatala hjärtan, har de praktiska aspekterna av att använda en sådan vävnad begränsat sin utforskning.

Baserat på den demonstrerade regenerativ kapacitet neonatal hjärta, har vi utvecklat nya matriser genom att utveckla entekniken med decellularisering för P3 mus hjärta. P3 hjärta valdes för dessa studier eftersom det är inom fönstret hjärt förnyelse som tidigare bestämts ⁶ men hjärtat är tillräckligt stor för att skörda, decellularize och recellularize. Målet med denna studie är att visa att det är möjligt att skapa en matris från en neonatal mus hjärta. Våra studier visar att möjligheten att decellularizing en minut, neonatal hjärta samtidigt som strukturella och proteinhaltigt integritet ECM. Vi visar också förmågan att recellularize denna hjärt ECM med mCherry uttrycker cardiomyocytes och vi har undersökt dessa kardiomyocyter för uttryck av olika hjärtmarkörer efter recellularization. Denna teknik gör det möjligt för testning av överlägsenhet en neonatal matris för utvecklingen av en bioartificiell hjärta.

Protocol

Alla mus experiment utfördes i enlighet med US djurskyddslagen och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Minnesota. 1. Metod för Mouse Heart Isolering Avliva en neonatal mus genom dekapitering med en enda användning blad. Tvätta bröstkorgen med 70% etanol. Dissekera huden från bröstkorgen genom att skära bort från bröstkorgen med standard sax samtidigt som du drar huden sidled med ett par # 5 pincett. Perforera b…

Representative Results

decellularisering I genomsnitt, tid att decellularisering av en P3 hjärtat med hjälp av detta protokoll är cirka 14 timmar. ges en genomsnittlig hjärtvikt av 23 mg för P3 nyfödda barnet. acellularitet Figur 3a visar en helt intakt P3 neonatal heart (hela montera). Figur 3b visar samma hjärtat efter decellulariseringen. Figurerna 4a och 4b …

Discussion

Beroendet av denna teknik vid upprepade perfusion av hjärtat gör undvikande av en blodpropp en kritisk komponent i ett framgångsrikt resultat. Från den första kateterisering av hjärtat i steg 2,2-2,6, till förändringarna i lösning mellan steg 2.8-2.14 finns manipulationer som kan tillåta införsel av luftbubblor som äventyrar flödet av perfusatet i hjärtmuskeln. På grund av den ringa storleken av den neonatala hjärta, kan även mycket små bubblor i kärl orsaka en teknisk infarkt, vilket gör det decellu…

Materials

1. Materials For Mouse Heart Isolation
P1 mouse pups (as shown; B6;D2-Tg(Myh6*-mCherry)2Mik/J)	Jackson Laboratories	21577	or equivalent
60 mm Culture dish	BD Falcon	353004	or equivalent
Phosphate buffered saline pH 7.4 (sterile)	Hyclone	SH30256.01	or equivalent
Single Use Blade	Stanley	28-510	or equivalent
Standard Scissors	Moria Bonn (Fine Science Tools)	14381-43	or equivalent
Spring Scissors 10 cm	Fine Science Tools	15024-10	or equivalent
Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-00	or equivalent
#5 Forceps	Dumnot (Fine Science Tools)	11295-00	or equivalent
2. Materials For Decellularization
Inlet adaptor	Chemglass	CG-1013	autoclavable
Septum	Chemglass	CG-3022-99	autoclavable
1/8 in. ID x 3/8 OD C-Flex tubing	Cole-Parmer	EW-06422-10	autoclavable
Male luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K33	autoclavable
Female luer to 1/8" hose barb adaptor	McMaster-Carr	51525K26	autoclavable
Prolene 7-0 surgical suture	Ethicon	8648G	or equivalent
Ring stand	Fisher Scientific	S47807	or equivalent
Clamp	Fisher Scientific	05-769-6Q	or equivalent
Clamp regular holder	Fisher Scientific	05-754Q	or equivalent
60 cc syringe barrel	Coviden	1186000777T	or equivalent
Beaker	Kimble	14000250	or equivalent
22g x 1 Syringe Needle	BD	305155	or equivalent
12 cc syringe	Coviden	8881512878	or equivalent
3-way stop cock	Smith Medical	MX5311L	or equivalent
22 x 1 g needle	BD	305155	or equivalent
PE50 tubing	BD Clay Adams Intramedic	427411	Must be formable by heat. Polyethylene recommended
1% SDS	Invitrogen	15525-017	Ultrapure grade recommended. Make up fresh solution and filter sterilize before use.
1% Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Make up fresh solution from a 10% stock and filter sterilize before use.
Sterile dH2O	Hyclone	SH30538.02	Or MilliQ system purified water.
1X Pen/Strep	Corning CellGro	30-001-Cl	or equivalent
3. Materials For DNA Quantitation
Proteinase K	Fisher	BP1700	>30U/mg activity
KCl	Sigma-Aldrich	P9333	or equivalent
MgCl*6H2O	Mallinckrodt	5958-04	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	or equivalent
Tris base/hydrochloride	Sigma-Aldrich	T1503/T5941	or equivalent
Pico-Green dsDNA assay kit	Life Technologies	P7589	requires fluorimeter to read
4. Method for fixation and sectioning of tissue.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	or equivalent
Gelatin Type A from porcine skin	Sigma-Aldrich	G2500	must be 300 bloom or greater
5. Method for tissue histology
Cryomolds 10 x 10 x 5mm	Tissue-Tek	4565	or equivalent
Cryostat	Hacker/Bright	Model OTF	or equivalent
Microscope Slides  25 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-19	or equivalent
Hematoxylin 560	Surgipath/Leica Selectech	3801570	or equivalent
Ethanol	Decon Laboratories	2701	or equivalent
Define	Surgipath/Leica Selectech	3803590	or equivalent
Blue buffer	Surgipath/Leica Selectech	3802915	or equivalent
Alcoholic Eosin Y 515	Surgipath/Leica Selectech	3801615	or equivalent
Formula 83 Xylene substitute	CBG Biotech	CH0104B	or equivalent
Permount Mounting Medium	Fisher Chemical	SP15-500	or equivalent
Collagen IV Antibody	Rockland	600-401-106.1	or equivalent
α-Actinin Antibody	Abcam	AB9465	or equivalent
mCherry Antibody	Abcam	AB205402	or equivalent
NKX2.5 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-8697	or equivalent
Donkey anti-mouse AF488 Antibody	Life Technology	A21202	or equivalent
Donkey anti-chicken AF594 Antibody	Jackson Immunoresearch	703-585-155	or equivalent
Donkey anti-goat CY5 Antibody	Jackson Immunoresearch	705-175-147	or equivalent
Fab Fragment Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AF594	Jackson Immunoresearch	111-587-003	or equivalent
Prolong Gold Antifade Mountant with DAPI	ThermoFisher	P36930	or equivalent
6. Isolation of neonatal ventricular cardiomyocytes using pre-plating.
HBSS (Ca, Mg Free)	Hyclone	SH30031.02	or equivalent
HEPES (1M)	Corning CellGro	25-060-Cl	or equivalent
Cell Strainer	BD Falcon	352340	or equivalent
50 mL tube	BD Falcon	352070	or equivalent
Primeria 100 mm plates	Corning	353803	Primeria surface enhances fibroblast attachment promoting a higher myocyte purity
Trypsin	Difco	215240	or equivalent
DNase II	Sigma-Aldrich	D8764	or equivalent
DMEM (Delbecco's Minimal Essential Media)	Hyclone	SH30022.01	or equivalent
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V6629	or equivalent
Fibronectin coated plates	BD Bioscience	354501	or equivalent
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30910.03	or equivalent
Heart bioreactor glassware	Radnoti Glass Technology	120101BEZ	Must be sterilizable by autoclaving or gas.