Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.
Örneğin, iltihabik bağırsak hastalığı, sıklığı, Crohn hastalığı ve ülseratif kolit, son yıllarda önemli ölçüde artmıştır. IBD etyolojisi bilinmemektedir ve mevcut tedavi stratejileri bağışıklık sisteminin baskılanması belirsiz dayanmaktadır. Özellikle belirgin IBD yönetimini geliştirmek olabilir bağırsak iltihabı ve epitel yara iyileşmesini hedefleyen tedavilerin geliştirilmesi, ancak bu iltihabi değişikliklerin doğru bir algılama gerektirir. Şu anda, potansiyel ilaç adayları, genellikle in vivo veya in vitro hücre kültürü bazlı tekniklerle hayvan modelleri kullanılarak değerlendirildi. Histolojik muayene genellikle örnek özelliklerini değiştirebilir ve ayrıca, bulguların yorumlanması araştırmacı uzmanlığı ile değişebilir hücreleri veya ilgi dokulara lekeli olması gerektirir. Dijital holografik mikroskobu (DHM), optik yol uzunluğu gecikme tespitine dayanan sağlar,leke bırakmayan kantitatif faz kontrast görüntüleme. Bu sonuçlar, doğrudan mutlak biyofizik parametreleri ile ilişkili olduğu için izin verir. Bu kırılma endeksi ölçümü göre DHM doku yoğunluğundaki değişiklikler ölçümü, kolitli farelerin ve insanlardan elde edilen kolon doku örneklerinin farklı tabakalarda, boyama olmaksızın, iltihaplı değişiklikler ölçmek için gösterilmektedir. Ayrıca, bu tür kuru kütle ve göç hücrelerin tabaka kalınlığı gibi yaralı alan ve morfolojik parametrelerin eş zamanlı tayini basit otomatik belirlenmesi yoluyla DHM kullanılarak in vitro mümkün epitel yara iyileşmesi sürekli multimodal etiket ücretsiz izleme göstermektedir. Sonuç olarak, DHM değerli, roman ve kantitatif aracı olası parametreler için mutlak değerler ile bağırsak iltihabı değerlendirilmesi için, in vitro epitel yara iyileşmesinin basitleştirilmiş miktarının temsil ve bu nedenle öteleme tanı u için yüksek bir potansiyele sahiptirse.
İltihaplı bağırsak yani hastalığı (IBD), ülseratif kolit (UC) ve Crohn hastalığı (CD), mide bağırsak 1 idiopatik enflamatuar hastalıklardır. IBD altta yatan patofizyoloji ve potansiyel yeni ilaçlar ya da yeni tanı yaklaşımları değerlendirmeye Araştırma özellikle önem taşımaktadır. Hem temel araştırma ve İBH hastalarının klinik yönetiminde, bağırsak mukoza dikkat 2,3 odağı haline gelmiştir. Mukoza bakterilere, epitel hücreleri, bağırsak, bağışıklık sisteminin çeşitli hücre bileşenleri arasındaki etkileşim bağırsak 4,5 homeostazı orkestra hangi anatomik sınırları temsil etmektedir. Ancak, İBH hastalarında, kontrolsüz ve kalıcı bağırsak iltihabı nihayet kendisi yerel inflamasyon 6 sinirlendiren epitel bariyer fonksiyonunun bozulması ile sonuçlanacak olabilir ülserasyonlar veya darlık gibi algılanabilir hasarı, mukozal yol açar.
<pclass = "jove_content"> epitel şifa inflamasyon aşağıdaki epitel rejenerasyonu için bu nedenle çok önemlidir ama aynı zamanda gastrointestinal cerrahi 7 sonrasında gastrointestinal ülser veya anastomoz kaçağı iyileşmesi için temel gereklilik olduğunu yara. Epitel şifa deneyleri şifa in vitro yara simüle ve bağırsak iltihabı 8,9 sıçan modellerinde olabilir yara. Hem in vitro ve in vivo yaklaşımlar deneysel değerlendirmenin doğruluğu sınırlayan sakıncaları var. In vitro deneyleri, klasik çizik deneyleri gibi, floresan kromoforlar ile uzun süren boyama yöntemleri veya transfeksiyon gerektirir. Genellikle 10 otomatik olamaz hücre proliferasyonu ve göçü devamlı olmayan izleme ile sınırlıdır. Dekstran sodyum sülfat (DSS) bağlı kolit in vivo modeller, sık olarak görülen önemli değişiklik, kısmen dayanıklı okumaları eksikliği laboratuvar belirteçleri de, mauygunsuz kral gibi belirteçler kolit şiddetini 11,12 değerlendirmek için. Iltihaplı mukozasında histolojik analiz şu anda hala kolit şiddetini belirlemek için en geçerli yöntemdir ancak bu, in vitro epitel yara iyileşme deneyleri gibi, boyama gerektirir ve araştırmacının uzmanlık 13 bağlıdır.En son dijital holografik mikroskobu (DHM), kantitatif faz mikroskobu 14 bir varyantı, in vitro ve in vivo 15 epitel yara iyileşmesinin değerlendirilmesi için yararlı bir araç olarak tespit edilmiştir. DHM (OPD) optik yol uzunluğu gecikme ölçümü doku yoğunluğunun değerlendirilmesini sağlar hangi umutları yeni kanser tanısı 16-18 ve inflamasyon ile ilgili doku değişikliklerinin 19 ölçümü. Ayrıca, DHM hücre kalınlığı, hücre kaplı yüzey alanı ve hücre içi (protein) içerik miktarının belirlenmesi ile hücre morfolojisi dinamikleri izlenmesine olanak sağlar <sup> 15,20. İn vitro tahlillerde, DHM fizyolojik süreçleri, örneğin, hücre hacmi ve kalınlık 21,22 değişimlerinin değerlendirilmesiyle hücresel su geçirgenliğinin analiz edilmesini sağlar. Ayrıca, DHM ölçümleri araştırmacı-ilişkili örnek önyargı engeller otomatik hale getirilebilir.
Burada, bağırsak iltihabı bir murin modelinde DHM kullanımını göstermek ve ayrıca bir etiket içermeyen in vitro deneyi olarak yara iyileşmesi kantitatif kontrolü için, insan doku numuneleri analizlerine dhm uygulanır. İlk olarak, IBD insanlardan, kolitli farelerin ve doku bölümleri farklı kolon duvar tabakalarının enflamatuar alterasyonların değerlendirir. DHM kantitatif faz görüntüleme işlemini anlattıktan sonra, biz edinilen sayısal faz görüntüler değerlendirilmesini tarif de mikroskop bileşenleri, doku kesitlerinin hazırlanması ve kullanımına ilişkin ayrıntılı yönergeler sağlar.
Daha sonra, DHM UTI olabileceğini göstermekin vitro epitel yara iyileşmesi sürekli multimodal izlenmesi için lized ve hücre tabakası kalınlığı, kuru kütlesinin ve hücresel hacmi gibi hücresel özelliklerinin analizini açıklar ilaca bağlı ve fizyolojik hücre değişiklikler hakkında fikir verir.
Bu DHM murin kolit modellerinde histolojik hasar ve insan kolon doku numuneleri ex vivo doğru değerlendirilmesini sağladığını gösterir. Ayrıca, DHM sürekli olarak aynı anda, hücresel değişiklikler hakkında çok modlu bilgi temin ederken epitel yara iyileşmesi takip göstermiştir. DHM olarak, dijital yakalanan hologramların yeniden sayısal 32 gerçekleştirilir. Bu nedenle, parlak bir alan mikroskobu, Zernike faz kontrast ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile kar…
The authors have nothing to disclose.
We thank Faekah Gohar for proofreading the manuscript. We thank Sonja Dufentester and Elke Weber for expert technical assistance.
Reagents | ||
Azoxymethane (AOM) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 |
Cell Culture Flask | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 658170 |
Costar Stripette | Corning Inc., New York, USA | 4488 |
Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 |
DMEM/Ham´s F12 | PAA Laboratories – Pasching – Austria | E15-813 |
EGF | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | SPR3196 |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 |
Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
Isopentane (2- Methylbutane) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L |
Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 |
Mitomycin C | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | M4287 |
Microscope Slides | G. Menzel, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ |
O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 |
Pen/Strep/Amphotericin B | Lonza, Verviers, Belgium | 1558 |
Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 |
RPMI 1640 | Lonza, Verviers, Belgium | 3626 |
Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 |
Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 |
Trypsin EDTA | Lonza, Verviers, Belgium | 7815 |
Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 |
µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high | ibidi GmbH, Munich, Germany | 81176 |
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert | ibidi GmbH, Munich, Germany | 80050 |
Equipment | ||
MICROM HM550 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA | 46320 |
Digital holographic microscope | ||
Component | Model | Company |
Inverted Microscope | iMIC | Till Photonics, Graefelfing, Germany |
Laser | Compass 315M | Coherent GmbH, Luebeck, Germany |
Microscope lens | Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 | Zeiss, Goettingen, Germany |
CCD camera | DMK 41BF02 | The Imaging Source, Bremen, Germany |