Multimodale Quantitative Phase Imaging con Digital olografico microscopia Valita accuratamente guarigione infiammazione intestinale e epiteliale della ferita
Summary
Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.
Abstract
L'incidenza della malattia infiammatoria intestinale, cioè, la malattia di Crohn e la colite ulcerosa, è notevolmente aumentato negli ultimi dieci anni. L'eziologia della IBD rimane sconosciuta e strategie terapeutiche attuali si basano sulla soppressione aspecifica del sistema immunitario. Lo sviluppo di trattamenti che colpiscono specificamente l'infiammazione intestinale e epiteliale guarigione della ferita potrebbe migliorare in modo significativo la gestione di IBD, ma questo richiede un rilevamento accurato di alterazioni infiammatorie. Attualmente, i potenziali candidati di droga sono solitamente valutati utilizzando modelli animali in vivo o con tecniche basate su colture cellulari in vitro. L'esame istologico di solito richiede le cellule oi tessuti di interesse per essere macchiati, che possono alterare le caratteristiche del campione e, inoltre, l'interpretazione dei risultati può variare dalla competenza investigatore. microscopio olografico digitale (DHM), basato sul rilevamento di ottica percorso ritardo di lunghezza, permette-Macchia libera di imaging a contrasto di fase quantitativa. In questo modo i risultati di essere direttamente correlati con i parametri biofisici assoluti. Si dimostra come la misurazione delle variazioni di densità dei tessuti con DHM, basato sulla misurazione dell'indice di rifrazione, in grado di quantificare le alterazioni infiammatorie, senza colorazione, in diversi strati di campioni di tessuto del colon da topi e nell'uomo con colite. Inoltre, abbiamo dimostrato il monitoraggio senza etichetta multimodale continuo di epiteliale guarigione delle ferite in vitro, possibile utilizzando DHM attraverso la semplice determinazione automatica della zona ferita e la determinazione simultanea di parametri morfologici come la massa secca e spessore dello strato di cellule che migrano. In conclusione, DHM rappresenta un prezioso, romanzo e strumento quantitativo per la valutazione di infiammazione intestinale con valori assoluti per i parametri possibili, la quantificazione semplificata di epiteliale guarigione delle ferite in vitro e quindi ha un elevato potenziale di u diagnostica traslazionaleSE.
Introduction
Le malattie infiammatorie intestinali (IBD), vale a dire, la colite ulcerosa (UC) e la malattia di Crohn (CD) sono malattie infiammatorie idiopatiche del tratto gastrointestinale 1. La ricerca sulla fisiopatologia delle IBD e la valutazione dei potenziali nuovi farmaci o nuovi approcci diagnostici è particolarmente importante. Sia nella ricerca di base e la gestione clinica dei pazienti IBD, la mucosa intestinale è diventato un centro dell'attenzione 2,3. La mucosa rappresenta un contorno anatomico, in cui l'interazione tra batteri commensali, cellule epiteliali e vari componenti cellulari del sistema immunitario intestinale orchestrare budello omeostasi 4,5. Tuttavia, nei pazienti con malattia infiammatoria intestinale, infiammazione intestinale incontrollata e persistente conduce alla mucosa danni, rilevabile come ulcerazioni o stenosi, che possono finalmente culminare nella composizione della funzione di barriera epiteliale, che a sua volta aggrava infiammazione locale 6.
<pclass = "jove_content"> epiteliale la guarigione della ferita è quindi fondamentale per la rigenerazione epiteliale dopo l'infiammazione, ma è anche un requisito fondamentale per la guarigione delle ulcere gastrointestinali o perdite anastomotica dopo la chirurgia gastrointestinale 7. Epiteliale guarigione della ferita può essere simulato in vitro ferita healing in vitro e in modelli murini di infiammazione intestinale 8,9. Sia in vitro e in vivo approcci hanno inconvenienti, che limitano la precisione della valutazione sperimentale. Saggi in vitro, come saggi scratch classici, richiedono procedure di colorazione prolungata o trasfezione con cromofori fluorescenti. Essi sono spesso limitati dalla loro monitoraggio discontinuo di proliferazione e migrazione cellulare che non può essere automatizzato 10. In vivo modelli, come destrano solfato sodico (DSS) colite indotta, spesso mancano robusti read-out, in parte dovuta alla variazione significativa visto in marker di laboratorio, mare tali marcatori inadeguati per valutare la colite gravità 11,12. L'analisi istologica della mucosa infiammata è attualmente ancora l'approccio più valido per determinare la gravità colite ma questo, come saggi di guarigione della ferita epiteliali in vitro, richiede colorazione e dipende dalla perizia del ricercatore 13.Recentemente digitale microscopio olografico (DHM), una variante della fase di microscopia quantitativa 14, è stato identificato come strumento utile per la valutazione dei epiteliale la guarigione delle ferite in vitro e in vivo 15. DHM permette valutazione della densità del tessuto misurando cammino ottico ritardo di lunghezza (OPD) , che la diagnosi di cancro prospettive romanzo 16-18 e la quantificazione dei relativi infiammazione alterazioni dei tessuti 19. Inoltre, DHM consente il monitoraggio delle dinamiche morfologia delle cellule per determinare lo spessore delle cellule, cellule superficie coperta e intracellulare (proteine) la quantità di contenuti <sup> 15,20. In saggi in vitro, DHM consente anche l'analisi dei processi fisiologici, ad esempio, permeabilità cellulare valutando variazioni di volume delle cellule e spessore 21,22. Inoltre, le misure DHM possono essere automatizzate che impedisce pregiudizi campione investigatore associato.
Qui, dimostriamo l'uso di DHM in un modello murino di infiammazione intestinale, e applichiamo anche DHM per l'analisi dei campioni di tessuti umani per il monitoraggio quantitativo di guarigione della ferita come un test in vitro senza etichetta. In primo luogo, valutiamo le alterazioni infiammatorie delle diverse pareti del colon-strati nei topi colitici e sezioni di tessuto da esseri umani con IBD. Dopo aver descritto la procedura di imaging fase quantitativa DHM, forniamo istruzioni dettagliate per l'uso dei componenti del microscopio, la preparazione di sezioni di tessuto e anche descrivere la valutazione delle immagini acquisite fase quantitativa.
Successivamente, dimostriamo che DHM può essere utizato per il monitoraggio continuo multimodale di epiteliale guarigione delle ferite in vitro, e descrivere l'analisi delle caratteristiche cellulari come spessore dello strato di cellule, massa secca e volume cellulare dare visione indotta da farmaci e cellule fisiologica alterazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo dimostrato che DHM fornisce una valutazione accurata del danno istologico in modelli murini colite e campioni ex vivo di tessuto del colon umano. Inoltre, abbiamo mostrato DHM può monitorare continuamente epiteliale guarigione della ferita mentre fornendo allo stesso tempo informazioni multimodale su alterazioni cellulari. In DHM, la ricostruzione di ologrammi catturate digitalmente viene eseguita numerico 32. Pertanto, in confronto al campo chiaro microscopia, contrasto di fase Zer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Faekah Gohar for proofreading the manuscript. We thank Sonja Dufentester and Elke Weber for expert technical assistance.
Materials
| Reagents | ||
| Azoxymethane (AOM) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | A5486 |
| Cell Culture Flask | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 658170 |
| Costar Stripette | Corning Inc., New York, USA | 4488 |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 |
| DMEM/Ham´s F12 | PAA Laboratories – Pasching – Austria | E15-813 |
| EGF | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | SPR3196 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
| Isopentane (2- Methylbutane) | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | M32631-1L |
| Methylene blue | Merck, Darmstadt, Germany | 1159430025 |
| Mitomycin C | Sigma – Aldrich, Deisenhofen, Germany | M4287 |
| Microscope Slides | G. Menzel, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 |
| Pen/Strep/Amphotericin B | Lonza, Verviers, Belgium | 1558 |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 |
| RPMI 1640 | Lonza, Verviers, Belgium | 3626 |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 |
| Trypsin EDTA | Lonza, Verviers, Belgium | 7815 |
| Vitro – Clud | R. Langenbrinck, Teningen, Germany | 04-0002 |
| µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high | ibidi GmbH, Munich, Germany | 81176 |
| DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert | ibidi GmbH, Munich, Germany | 80050 |
| Equipment | ||
| MICROM HM550 | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA | 46320 |
| Digital holographic microscope | ||
| Component | Model | Company |
| Inverted Microscope | iMIC | Till Photonics, Graefelfing, Germany |
| Laser | Compass 315M | Coherent GmbH, Luebeck, Germany |
| Microscope lens | Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3 | Zeiss, Goettingen, Germany |
| CCD camera | DMK 41BF02 | The Imaging Source, Bremen, Germany |
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