This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.
Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.
Cytoplasmisk mikroinjektion av embryon 1-cell är en mycket kraftfull teknik. Det kan användas för att leverera en lösning i embryot till, till exempel, producera genprodukter knock-outs för att studera genfunktion eller för att generera gen-redigerade djur. Mest agrikulturellt relevanta husdjurs zygotes har en mycket hög fettsyrasammansättning som gör deras cytoplasma ogenomskinlig och mörk en. De har också en ganska elastiskt plasmamembran (PM). Dessa egenskaper gör mikroinjektion med användning av konventionell pronukleär / cytoplasma injektion som används i gnagare utmanande och ofta felaktiga.
Cytoplasmisk mikroinjektion har fördelar jämfört med pronukleär mikroinjektion eftersom det är lättare att utföra och orsakar också mindre skador på de injicerade embryon, vilket resulterar i högre lönsamhet 2. Det övergripande målet med detta protokoll är att visa en framgångsrik metod för att leverera lösningar i cytoplasman av husdjurs zygoter. För att kunna utföracytoplasmisk mikroinjektion med hög effektivitet på embryon boskap, är en laser används för att generera ett hål i zona pellucida (ZP) och sedan en trubbig ände glasnål används för mikroinjektion. Denna strategi syftar till att minska den mekaniska skador tryckt på embryot under injektion. Därefter, aspiration av cytoplasmisk innehåll i injektionsnålen möjliggör effektiv och säker brott på PM säkerställa att lösningen levereras i cytoplasman av embryot.
Denna teknik har redan använts framgångsrikt i embryon från nötkreatur för att leverera siRNA in i zygotiska cytoplasman 3,4 och generera mutationer med hjälp av klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (crispr) / crispr tillhörande system 9 (Cas9) systemet 5. Det är också lämpligt (med smärre ändringar) för att injicera nötkreatur cumulus-inneslutna oocyter 6. Här beskriver vi vår injektionsprotokoll leverera ett färgämne, som kan tillämpas på injicering någon desired lösning i zygoten, och visar att användningen av denna teknik orsakar minimal lys och påverkar inte tidig embryoutveckling.
Mikroinjektion av zygoter är en väletablerad metod för att införa lösningar i däggdjursembryon. Med vissa variationer beroende på djurart och syftet med experimentet, kan denna teknik användas brett. Vi visar hur man utför intracytoplasmatisk mikroinjektion med hjälp av en laser för att underlätta ingången till en trubbig ände mikropipett. Zygoter av vissa djurarter (såsom nötkreatur, får och svin) har en mörk cytoplasma, hindrar visualisering av injektions pipett en gång inne i embryot. Även deras p…
The authors have nothing to disclose.
Work related to this technique is supported by NIH/NICHD RO1 HD070044 and USDA/NIFA Hatch projects W-3171 and W-2112.
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
Glass capillary | Sutter instruments | B100-75-10 | These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used. |
Microforge | Narishige | MF-9 | Equipped with 10X magnification lense. |
Micromanipulator | Nikon/ Narishige | NT88-V3 | |
Inverted microscope | Nikon | TE2000-U | Equipped with 4x, 20x lenses and with a laser system. |
Laser | Research Instruments | 7-47-500 | Saturn 5 Active laser. |
Microdispenser | Drummond | 3-000-105 | The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible. |
60mm culture dish | Corning | 430166 | Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micropipettes with the micromanipulator easier. |
35mm culture dish | Corning | 430165 | These dishes are used for culturing the embryos in 50μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hours prior to transfering the embryos to them. |
Incubator | Sanyo | MCO-19AIC | Any incubator that can be set to 38.5°C 5% CO2 conditions can be used. |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10x magnification can be used. |
Control Unit HT | Minitube | 12055/0400 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
Heated Microscope Stage | Minitube | 12055/0003 | Heating system attached to the stereomicroscope. |
Dextran-Red | Thermo Scientific | D1828 | A sterile 10mg/ml solution is used to inject. |
Mineral Oil | sigma | M8410 | Keep the mineral oil at room temperature and protected from light using foil paper. |
KSOMaa Evolve Bovine | Zenit | ZEBV-100 | Supplemented with 4mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hours before use. |
FBS | Gemini-Bio | 100-525 | Use a stem-cell qualified FBS. |
Zygotes | Zygotes are injected 17-20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived. | ||
NaCl | Sigma | S5886 | Final concentration: 107.7mM. Component of SOF-HEPES medium. |
KCl | Sigma | P5405 | Final concentration: 7.16mM. Component of SOF-HEPES medium. |
KH2PO4 | Sigma | P5655 | Final concentration: 1.19mM. Component of SOF-HEPES medium. |
MgCL2 6H2O | Sigma | M2393 | Final concentration: 0.49mM. Component of SOF-HEPES medium. |
Sodium DL-lactate | Sigma | L4263 | Final concentration: 5.3mM. Component of SOF-HEPES medium. |
CaCl2-2H2O | Sigma | C7902 | Final concentration: 1.71mM. Component of SOF-HEPES medium. |
D-(−)-Fructose | Sigma | F3510 | Final concentration: 0.5mM. Component of SOF-HEPES medium. |
HEPES | Sigma | H4034 | Final concentration: 21mM. Component of SOF-HEPES medium. |
MEM-NEAA | Sigma | M7145 | Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium. |
BME-EAA | Sigma | B6766 | Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium. |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Final concentration: 4mM. Component of SOF-HEPES medium. |
Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | Final concentration: 0.33mM. Component of SOF-HEPES medium. |
Glutamax | Gibco | 35050 | Final concentration: 1mM. Component of SOF-HEPES medium. |
BSA | Sigma | A-3311 | Final concentration: 1mg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
Gentamicin | Sigma | G-1397 | Final concentration: 5μg/ml. Component of SOF-HEPES medium. |
Water for embryo transfer | Sigma | W1503 | Component of SOF-HEPES medium. |
SOF-HEPES medium | Made in the lab | pH 7.3-7.4, 280±10 mOs. Filter sterilized through a 22μm filter can be stored in the fridge at 4° C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use. |