Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

Summary

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Abstract

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Introduction

microiniezione citoplasmatica di embrioni di 1-Cell è una tecnica molto potente. Può essere usato per erogare qualsiasi soluzione nell'embrione, per esempio, producono gene knock-out per studiare la funzione del gene o per generare animali geni modificati. La maggior parte agricolo-zigoti rilevanti animali da allevamento hanno una composizione molto alto acido grasso che rende il loro citoplasma opachi e scuri ^1. Hanno anche una membrana plasmatica mediamente elastiche (PM). Queste caratteristiche rendono la microiniezione utilizzando convenzionale pronuclear iniezione / citoplasmatica usati in specie di roditori impegnative e spesso imprecisi.

Microiniezione citoplasmatica ha dei vantaggi rispetto microiniezione pronuclear poiché è più facile da eseguire e provoca anche meno danni agli embrioni iniettati, con conseguente maggiore vitalità ^2. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare un metodo di successo per fornire soluzioni nel citoplasma degli zigoti animali da allevamento. Per poter eseguiremicroiniezione citoplasmatica con alta efficienza sugli embrioni bestiame, un laser viene utilizzato per generare un foro nella zona pellucida (ZP) e poi un ago di vetro smussato-end viene utilizzato per la microiniezione. Questa strategia mira a ridurre il danno meccanico impresso l'embrione durante l'iniezione. Poi, l'aspirazione del contenuto citoplasmatica dentro l'ago dell'iniezione permette la rottura efficiente e sicuro del PM garantire che la soluzione è consegnato nel citoplasma dell'embrione.

Questa tecnica è già stata utilizzata con successo in embrioni di bovini per fornire siRNA nel citoplasma zygotic ^3,4 e generare mutazioni utilizzando i cluster si ripete regolarmente intervallati brevi palindromi (CRISPR) / CRISPR associato sistema 9 Sistema ⁵ (Cas9). E 'anche adatto (con piccole modifiche) per iniettare bovini ovociti cumulo-racchiuso ^6. Qui, descriviamo il nostro protocollo di iniezione fornire un colorante, che può essere applicabile a qualsiasi iniezione dessoluzione ired nel zigote, e mostrano che l'utilizzo di questa tecnica provoca la lisi minima e non influenza lo sviluppo embrionale precoce.

Protocol

1. Micropipetta Produzione micropipetta iniezione Posizionare un capillare di vetro borosilicato (diametro esterno (OD): 1,0 mm, diametro interno (ID): 0.75 mm) in un estrattore micropipetta (al centro dei titolari dei diritti e capillari sinistra) e bloccarlo. Utilizzare un programma appropriato per tirare il capillare di vetro in modo che si traduce in una punta sottile con una lunga tapper. (Esempio: Heat: 825; Pull: 30; Velocity: 120; Tempo: 200; Pressione: 500). Rimuovere con…

Representative Results

Laser-assistita microiniezione citoplasmatica è un protocollo potente e affidabile per fornire soluzioni nel citoplasma di zigoti bestiame. La figura 3 mostra uno schema generale dei zigoti prima e dopo l'iniezione e la sagoma complessiva della tecnica. Destrano-rosso viene usato come iniettare soluzione per consentire il monitoraggio sito di iniezione e iniezione efficienza e precisione. Il raggiungimento della soluzione è illustrata nella figura 4</strong…

Discussion

Microiniezione di zigoti è un metodo consolidato per l'introduzione di soluzioni in embrioni di mammiferi. Con alcune variazioni dipendenti dalla specie e l'obiettivo dell'esperimento, questa tecnica può essere utilizzata largamente. Mostriamo come eseguire microiniezione intracitoplasmatica utilizzando un laser per assistere all'ingresso di una micropipetta smussato-end. Zigoti di alcune specie di bestiame (come bovini, ovini, suini e) hanno un citoplasma scuro, ostacolando la visualizzazione della pi…

Materials

Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Glass capillary	Sutter instruments	B100-75-10	These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge	Narishige	MF-9	Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Inverted microscope	Nikon	TE2000-U	Equipped with 4x, 20x lenses and with a laser system.
Laser	Research Instruments	7-47-500	Saturn 5 Active laser.
Microdispenser	Drummond	3-000-105	The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
60mm culture dish	Corning	430166	Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micropipettes with the micromanipulator easier.
35mm culture dish	Corning	430165	These dishes are used for culturing the embryos in 50μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hours prior to transfering the embryos to them.
Incubator	Sanyo	MCO-19AIC	Any incubator that can be set to 38.5°C 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope	Nikon	SMZ800	Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10x magnification can be used.
Control Unit HT	Minitube	12055/0400	Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage	Minitube	12055/0003	Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	A sterile 10mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil	sigma	M8410	Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Supplemented with 4mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hours before use.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes			Zygotes are injected 17-20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl	Sigma	S5886	Final concentration: 107.7mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl	Sigma	P5405	Final concentration: 7.16mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4	Sigma	P5655	Final concentration: 1.19mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCL2 6H2O	Sigma	M2393	Final concentration: 0.49mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate	Sigma	L4263	Final concentration: 5.3mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Final concentration: 1.71mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose	Sigma	F3510	Final concentration: 0.5mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES	Sigma	H4034	Final concentration: 21mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA	Sigma	B6766	Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3	Sigma	S5761	Final concentration: 4mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate	Sigma	P4562	Final concentration: 0.33mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax	Gibco	35050	Final concentration: 1mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA	Sigma	A-3311	Final concentration: 1mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin	Sigma	G-1397	Final concentration: 5μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer	Sigma	W1503	Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium	Made in the lab		pH 7.3-7.4, 280±10 mOs. Filter sterilized through a 22μm filter can be stored in the fridge at 4° C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.