Laser-assisted cytoplasmatisk mikroinjektion i Boskap Zygoter

Summary

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Abstract

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Introduction

Cytoplasmisk mikroinjektion av embryon 1-cell är en mycket kraftfull teknik. Det kan användas för att leverera en lösning i embryot till, till exempel, producera genprodukter knock-outs för att studera genfunktion eller för att generera gen-redigerade djur. Mest agrikulturellt relevanta husdjurs zygotes har en mycket hög fettsyrasammansättning som gör deras cytoplasma ogenomskinlig och mörk ^en. De har också en ganska elastiskt plasmamembran (PM). Dessa egenskaper gör mikroinjektion med användning av konventionell pronukleär / cytoplasma injektion som används i gnagare utmanande och ofta felaktiga.

Cytoplasmisk mikroinjektion har fördelar jämfört med pronukleär mikroinjektion eftersom det är lättare att utföra och orsakar också mindre skador på de injicerade embryon, vilket resulterar i högre lönsamhet ^2. Det övergripande målet med detta protokoll är att visa en framgångsrik metod för att leverera lösningar i cytoplasman av husdjurs zygoter. För att kunna utföracytoplasmisk mikroinjektion med hög effektivitet på embryon boskap, är en laser används för att generera ett hål i zona pellucida (ZP) och sedan en trubbig ände glasnål används för mikroinjektion. Denna strategi syftar till att minska den mekaniska skador tryckt på embryot under injektion. Därefter, aspiration av cytoplasmisk innehåll i injektionsnålen möjliggör effektiv och säker brott på PM säkerställa att lösningen levereras i cytoplasman av embryot.

Denna teknik har redan använts framgångsrikt i embryon från nötkreatur för att leverera siRNA in i zygotiska cytoplasman ^3,4 och generera mutationer med hjälp av klustrade regelbundet mellanrum korta palindromiska upprepningar (crispr) / crispr tillhörande system 9 (Cas9) systemet ^5. Det är också lämpligt (med smärre ändringar) för att injicera nötkreatur cumulus-inneslutna oocyter ^6. Här beskriver vi vår injektionsprotokoll leverera ett färgämne, som kan tillämpas på injicering någon desired lösning i zygoten, och visar att användningen av denna teknik orsakar minimal lys och påverkar inte tidig embryoutveckling.

Protocol

1. Mikropipett Produktion injektion mikropipett Placera en borosilikatglas kapillär (ytterdiameter (OD): 1,0 mm, innerdiameter (ID): 0,75 mm) i en mikropipett avdragare (i mitten av höger och vänster kapillär hållare) och låsa den. Använd ett lämpligt program för att dra glaset kapillär så det resulterar i en tunn spets med en lång tapper. (Exempel: Värme: 825; Pull: 30; Hastighet: 120; Tid: 200; Tryck: 500). Försiktigt bort drog pipetter från enheten och placera de…

Representative Results

Laser-assisted cytoplasma mikroinjektion är en kraftfull och pålitlig protokoll för att leverera lösningar i cytoplasman av boskaps zygoter. Figur 3 visar en allmän översikt över de zygoter före och efter injektion samt övergripande beskrivning av tekniken. Dextran-rött används som injicera lösningen för att tillåta spårning injektionsstället och injektion effektivitet och noggrannhet. Framgångsrik leverans av lösningen illustreras i Figur 4</st…

Discussion

Mikroinjektion av zygoter är en väletablerad metod för att införa lösningar i däggdjursembryon. Med vissa variationer beroende på djurart och syftet med experimentet, kan denna teknik användas brett. Vi visar hur man utför intracytoplasmatisk mikroinjektion med hjälp av en laser för att underlätta ingången till en trubbig ände mikropipett. Zygoter av vissa djurarter (såsom nötkreatur, får och svin) har en mörk cytoplasma, hindrar visualisering av injektions pipett en gång inne i embryot. Även deras p…

Materials

Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
Glass capillary	Sutter instruments	B100-75-10	These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.
Microforge	Narishige	MF-9	Equipped with 10X magnification lense.
Micromanipulator	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Inverted microscope	Nikon	TE2000-U	Equipped with 4x, 20x lenses and with a laser system.
Laser	Research Instruments	7-47-500	Saturn 5 Active laser.
Microdispenser	Drummond	3-000-105	The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.
60mm culture dish	Corning	430166	Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micropipettes with the micromanipulator easier.
35mm culture dish	Corning	430165	These dishes are used for culturing the embryos in 50μl drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hours prior to transfering the embryos to them.
Incubator	Sanyo	MCO-19AIC	Any incubator that can be set to 38.5°C 5% CO2 conditions can be used.
Stereomicroscope	Nikon	SMZ800	Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10x magnification can be used.
Control Unit HT	Minitube	12055/0400	Heating system attached to the stereomicroscope.
Heated Microscope Stage	Minitube	12055/0003	Heating system attached to the stereomicroscope.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	A sterile 10mg/ml solution is used to inject.
Mineral Oil	sigma	M8410	Keep the mineral oil at room temperature and  protected from light using foil paper.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Supplemented with 4mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hours before use.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Use a stem-cell qualified FBS.
Zygotes			Zygotes are injected 17-20 hpf and can be in-vitro- or in-vivo-derived.
NaCl	Sigma	S5886	Final concentration: 107.7mM. Component of SOF-HEPES medium.
KCl	Sigma	P5405	Final concentration: 7.16mM. Component of SOF-HEPES medium.
KH2PO4	Sigma	P5655	Final concentration: 1.19mM. Component of SOF-HEPES medium.
MgCL2 6H2O	Sigma	M2393	Final concentration: 0.49mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium DL-lactate	Sigma	L4263	Final concentration: 5.3mM. Component of SOF-HEPES medium.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Final concentration: 1.71mM. Component of SOF-HEPES medium.
D-(−)-Fructose	Sigma	F3510	Final concentration: 0.5mM. Component of SOF-HEPES medium.
HEPES	Sigma	H4034	Final concentration: 21mM. Component of SOF-HEPES medium.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
BME-EAA	Sigma	B6766	Final concentration: 1X. Component of SOF-HEPES medium.
NaHCO3	Sigma	S5761	Final concentration: 4mM. Component of SOF-HEPES medium.
Sodium pyruvate	Sigma	P4562	Final concentration: 0.33mM. Component of SOF-HEPES medium.
Glutamax	Gibco	35050	Final concentration: 1mM. Component of SOF-HEPES medium.
BSA	Sigma	A-3311	Final concentration: 1mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Gentamicin	Sigma	G-1397	Final concentration: 5μg/ml. Component of SOF-HEPES medium.
Water for embryo transfer	Sigma	W1503	Component of SOF-HEPES medium.
SOF-HEPES medium	Made in the lab		pH 7.3-7.4, 280±10 mOs. Filter sterilized through a 22μm filter can be stored in the fridge at 4° C for 1 month. Warm in 37 °C water bath before use.