PI (4،5) ف 2 تنظم مختلف الوظائف الخلوية، ولكن من المفهوم منظمة النانوية في غشاء الخلية البلازما سيئة. بوصف PI (4،5) ف 2 مع التحقيق الذي تجريه الفلورسنت ثنائي اللون تنصهر إلى المجال Pleckstrin التماثل، ونحن تصف نهجا جديدا لدراسة PI (4،5) ف 2 التوزيع المكاني في غشاء البلازما على مقياس متناهي الصغر .
Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.
تسهم Phosphoinositides إلى جزء صغير من الدهون الكلية الغشاء، ولكن تلعب أدوارا حاسمة في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية. وتشمل سبعة أعضاء المستمدة من الفسفرة عكسها أو نزع الفسفات من الحلقات إينوزيتول في الثالث 3 و 4 و ال مواقف ال 5 +1. فوسفتيدلينوستول 4-الفوسفات (PI4P) وفوسفتيدلينوستول 4،5-bisphosphate (PI (4،5) ف 2) هما phosphoinositides الكبرى التي تعمل بشكل مستقل نسبيا مثل الدهون المحدد من غشاء الخلية البلازما (بعد الظهر) 2،3. فوسفتيدلينوستول (3،4،5) -trisphosphate (PIP 3) وهو أقل انتشارا بكثير من PI4P وPI (4،5) ف 2، لكنه لا يملك ظائف فريدة من نوعها في العمليات الخلوية المختلفة بما في ذلك السرطان والسكري 4 5. هذه الدهون لها التفاعلات الجزيئية المعقدة مع المؤثرات الخاصة والعديد من البروتينات الأخرى. ولذلك، من المهم أن نفهم التنظيم المكاني لهذه هواتفsphoinositides في رئيس الوزراء على مقياس متناهي الصغر.
وقد أظهرت أدلة متزايدة على أن المجمعات البروتين أو الكتل جزيء في المناطق PM تقتصر يمكن أن تكون بمثابة إشارات النقاط الساخنة (6). على سبيل المثال، syntaxin 1A، وهو بروتين الرئيسي الذي ينظم الغشاء الانصهار 7-9، يعرض تنظيم العنقودية في PM. متميزة عن رأي توافقي المنظمة مجموعة من syntaxin 1A، والتوزيع المكاني للphosphoinositides في PM مثير للجدل. وتتراوح أنماط PI (4،5) ف 2 توزيع من الزي 10-12، بقع كبيرة 13،14، إلى كثيفة مجموعات 14-18، اعتمادا على أنواع الخلايا والطرق التجريبية المستخدمة. التنظيم المكاني للPI (4،5) ف 2 في دقة أعلى هو أيضا غير متناسقة. دراسة استخدام حفز الانبعاثات استنفاد (STED) المجهري 19 قد كشفت عن وجود عدد كبير من PI كثيفة (4،5) ف 2 نانو مجموعات (~ 73 نانومتر في القطر) في رئيس الوزراء ورقة من PC-12 زنزانة 20 </sتصل>. هذه النتيجة مختلفة من الدراسات باستخدام المجهر سريعة تجميد الإلكترون (EM) 21،22، وهو النهج الذي يحفظ PM بنية سليمة من الخلايا الحية أفضل بكثير من التثبيت الكيميائية. وأظهر هذا الأخير حمامات متميزة من PI (4،5) ف 2. PI مركزة نسبيا (4،5) ف 2 في caveolae والمغلفة حفر وكذلك توزيع موحد على المنطقة PM مسطحة. وعلاوة على ذلك، PI النانو (4،5) ف 2 المنظمة في ورقة الغشاء قد تختلف في الخلايا الحية والثابتة. التحقيق عملنا مؤخرا هذه المسألة في الخلايا INS-1 الثابتة والعيش على حد سواء باستخدام جزيء واحد توطين المجهري (SMLM) 23.
ويستند SMLM على التحول عشوائيا على مجموعة فرعية صغيرة فقط من fluorophores في أي وقت معين بحيث يمكن أن تكون مترجمة fluorophores الفردية بدقة عالية. وقد وضعت العديد من المناهج التصوير فائقة الدقة باستخدام مبادئ مماثلة لتجاوز الحد حيود المجهر الضوئي التقليدية، مثل هذاالصورة تنشيط ضوئي توطين المجهري (النخيل) 24، مضان تنشيط ضوئي توطين المجهري (FPALM) 25، ستوكاستيك إعادة البناء الضوئي المجهري (STORM) 26،27 وSTORM المباشر (dSTORM) 28. مع الصور للتحويل أو fluorophores photoactivatable (الأصباغ أو البروتينات الفلورية)، وتقنيات SMLM تسمح للعلماء للهياكل البيولوجية الصورة في قرار نانومتر 24،29،30 مع معدل الفيديو في الخلايا الحية 31،32.
باستخدام PI (4،5) ف 2 كمثال على ذلك، قدمنا نهج SMLM لدراسة توزيع النانو من phosphoinositides على رئيس الوزراء. المجال PH من PLCδ1 (فسفوليباز C δ1) الذي يربط خصيصا لPI (4،5) ف 2 هو التحقيق راسخة للتصوير PI (4،5) ف 2 توزيع فرعية الخلوي وديناميات 33،34 في PM . لقد الموسومة راثيا هذا المجال مع اثنين من البروتينات الفلورية، PAmCherry1 35 و 36 iRFP </سوب> لإنتاج ثنائي اللون الانصهار البروتين (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (الشكل 1A-B). يقدم PAmCherry1 كما التحقيق photoactivatable المجال PH للنخلة ويخدم iRFP كمؤشر عام لتحديد الخلايا transfected قبل اكتساب PALM . نحن نطبق هذا ثنائي اللون الفلورسنت التحقيق للتصوير SMLM في الأوراق غشاء ثابتة. للتصوير PALM الحية، ونحن الموسومة mEOS3 37 بدلا من PAmCherry1 إلى المجال PH PLCδ1 لتوليد PLCδ1 التحقيق mEOS3.1-PH للتحسين الكفاءة الفوتون والسطوع (الشكل 1C-D).
كشفت SMLM التصوير مع هذه التحقيقات الجديدة في رئيس الوزراء من إفراز الأنسولين INS-1 خلايا 38 العلامات متجانس من PI (4،5) ف 2 في معظم المناطق PM فضلا PI المركزة (4،5) ف 2 microdomains التي اختلط قليلة في PM مسطحة وبعض هياكل تشبه أرجل كاذبة خيطية 23. ثمتوزيع noscale من PI (4،5) ف 2 يوفر قاعدة الهيكلية لإعادة التفكير كيف يعمل في الخلايا الحية.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها، تحتاج عمليتين اهتمام إضافي: إنتاج ورقة الغشاء وتثبيت عينة. كما هو موضح في البروتوكول، وفترة حضانة لل coverslips في الخطوة 1.1.6 مهم لإنتاج ورقة الغشاء. الأمثل فترة حضانة تحت ظروف تجريبية لدينا هو 7-10 دقيقة (الشكل 2). أطول من 10 دقيقة حضانة وإنتاج خلايا سليمة بدلا من صفائح الأغشية coverslips على PDL وحضانة أقصر سوف يؤدي إلى أي ورقة الغشاء على لل coverslips المغلفة PDL أقل أو. كما هو موضح في البروتوكول، ومثبتات ودرجة الحرارة أثناء تثبيت حاسمة للحفاظ على PI (4،5) ف 2 توزيع في PM. تثبيت في RT أو استخدام 4٪ -PFA وحده يمكن أن يشوه توزيع الدهون الطبيعي في PM.
من خلال تطبيق PALM المجهري لغشاء البحوث الدهون، ونحن قادرون على مراقبة توزيع نطاق نانومتر من PI (4،5) ف 2، فسفوإينوزيتيد الرئيسي الذي يتوسط مأي أنشطة الخلوية الأساسية. هذا التوزيع المكاني للPI (4،5) ف 2 مع التدرجات تركيز محدودة في INS-1 خلايا يوفر إطارا لإعادة النظر في التفاعلات دهون، بروتين والأحداث الإشارات المحلية من PI (4،5) ف 2 في هذه الخلايا. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا أن تطبق الأساليب المتقدمة في هذا العمل لبحث غشاء فوسفورية أخرى مع تحقيقات سليمة، وبالتالي، توفير أدوات جديدة لدراسة phosphoinositides في العمليات البيولوجية.
استخدام ورقة الغشاء في هذا العمل يتجاوز اثنين من الشواغل الرئيسية في الدراسات المورفولوجية فوسفورية: العلاج المنظفات والتلوث إشارة محتملة من العصارة الخلوية. وغالبا ما تسبب المنظفات تجميع وخسائر كبيرة في إشارة PM فوسفورية. تلوث إشارة عصاري خلوي إشكالية خاصة في حالة انخفاض phosphoinositides فرة على رئيس الوزراء 23، مثل PI (3،4،5) ف 3 و PI (3،4) ف 2. عينات ورقة غشاء قادرة على التعmvent هذه المشاكل دون تعطيل كبير الهياكل المرتبطة غشاء البلازما، مثل شبكه الأكتين القشرية وحفر المغلفة بالكلاذرين 42،43. توزيع متجانس نسبيا من PI (4،5) ف 2 في رئيس الوزراء هو في اتفاق جيد مع دراسات تجميد EM سريعة أخرى باستخدام GST-PH PLC تحقيقات δ1 في غشاء الخلايا الليفية 44.
من المهم أن نلاحظ أن الظروف تجهيز العينات غير سليمة يمكن أن تولد نتائج مضللة. أولا، من المهم جدا لتنفيذ الخطوات التثبيت في انخفاض درجة الحرارة (4 درجة مئوية) واستخدام مثبت GA لإنتاج ورقة الغشاء. كما هو مبين في الشكل (3)، ودرجة الحرارة الدافئة ومنهاج العمل التثبيت دون GA لا تكفي لإصلاح phosphoinositides في الخلية PM. وهذا يمكن أن تشوه PI سليمة (4،5) ف 2 توزيع وتوليد مجموعات الحادة التي لا تراعى في الخلايا الحية في ظل الظروف الفسيولوجية. ثانيا، استخدام PAmCherry1 كماالتحقيق SMLM، بدلا من تحقيقات أخرى، أمرا حيويا من أجل التصوير PALM الكمي. صالح تطبيق PAmCherry1 تأتي من خصائصه جيدا اتسم احدة الجزيئية الصورة المادية 35،40،45، مثل السطوع، وارتفاع كفاءة الصورة تفعيل والأهم من ذلك كله، محدودة جدا الصور وامض. هذه الخصائص تمكننا من القضاء على القطع الأثرية مجموعة محتملة من الصور وامض وكميا تحليل كثافة الجزيئية من PI غشاء (4،5) ف 2.
ويتميز هذا النهج أيضا حدوده. أولا، وطريقة ورقة الغشاء المستخدمة في هذه الدراسة قد لا تحاكي تماما التوزيع الفسيولوجي للPI (4،5) ف 2 لأنه عطل الخلية قبل التصوير. ومع ذلك، يظهر لدينا التصوير PALM الحية توزيع متجانس نسبيا مماثل من PI (4،5) ف 2، ودعم النتائج الملاحظة مع عينات ورقة الغشاء. ثانيا، كما ناقشنا في الأعمال السابقة لدينا 23، SMLM يتطلب خبرة التصوير وخارج فيالاحتجاز التابعة لتفادي القطع الأثرية التصوير التي قد تنشأ من عمليات مختلفة، بما في ذلك تحقيقات المستخدمة، وإعداد العينات وتثبيت، وأخذ العينات الصورة وإعادة الإعمار. وأخيرا، على الرغم من تحقيقات والأجسام المضادة على أساس المجال PH استخدمت على نطاق واسع في الدراسات فسفوإينوزيتيد 46،47 أنه لا يزال من الممكن أن ليس كل PI (4،5) ف 2 في الغشاء يمكن الكشف عن هذا النهج. على سبيل المثال، PI (4،5) ف 2 ملزمة البروتينات الذاتية أخرى قد لا تكون في متناول تحقيقات PH أو الأجسام المضادة، وهذا قد يؤدي إلى التقليل من PI (4،5) ف 2 بسبب عائق الفضاء من تحقيق ذاتها. وهناك طريقة بديلة من (4،5) ف 2 العلامات PI أن تستخدم أعلى فلور PI (4،5) P 2 48، وPI وصفت مسبقا (4،5) ف 2 التناظرية مع تعديل على ذيل الأصلي PI (4،5) ف 2. ومع ذلك، فإنه يمكن تحويلها بسرعة إلى أنواع فرعية فسفوإينوزيتيد الأخرى عن طريق سريع استقلاب الخلية الحية منذ حلقة إينوزيتول لها هي نفس endogenouالصورة PI (4،5) ف 2. وهذا يثير قلق ما إذا كان هذا المسمى قبل PI (4،5) ف 2 التناظرية في الخلايا الحية يمكن أن تمثل بأمانة PI (4،5) ف 2 بدلا من المنتجات الأيضية لها. لذلك، على الرغم من بعض القيود، تحقيقات يستند إلى مجال PH لا تزال من بين أفضل تحقيقات التي استخدمت على نطاق واسع لمراقبة PI (4،5) ف 2 توزيع وديناميكية على رئيس الوزراء من الخلايا.
ويمكن تمديد تطبيقها في المستقبل من هذه المنهجية لدراسات فسفوإينوزيتيد أخرى، مثل PI (3،4،5) ف 3 و PI (3،4) ف 2. وباختصار، فإن نهج SMLM رواية المستخدمة هنا يفتح طرق جديدة لدراسة فسفوإينوزيتيد في الخلايا. باستخدام PI (4،5) ف 2 كمثال على ذلك، ونحن لشرح خصائص فريدة من نوعها من التصوير PALM في الدراسة المورفولوجية وكمية من جزيئات الغشاء الخلوي، فضلا عن عيوبها. هذا النهج يمكن أن تتكيف مع جزيئات أخرى من المصالح، وسيكون له تطبيقات واسعة في بيولوجيا الخلية.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).
Microscope | Nikon | Ti-U | |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
Spinning disk | Yokogawa | CSU X-1, 10,000 rpm | |
High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. | Agilent | MLC400 | laser original powers & powers at the end of optical fiber) 405nm: 15 mW & 13 mW; 488nm: 45 mW & 42 mW; 561nm: 45 mW & 40 mW; 640nm: 35 mW & 16 mW. |
100X Objective | Nikon | APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm | |
Nikon acquisition and analysis software(NIS Element) | Nikon | ||
Matlab | MathWorks | ||
Coverslip | Warner | 64-0714 | Round 18mm coverslip, #1.5 |
Fibronectin | Millipore | FC010-5MG | |
Lipofectamin 3000(transfection reagent) | Invitrogen | L3000-008 | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | #16120 | |
PI(4,5)P2 1st antibody | Santa Cruz | sc-53412 | |
secondary antibody F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21237 | |
Tetraspeck beads | Invitrogen | T7279 | |
magnetic quick release imaging chamber | Warner Instruments | Cat#641994 | |
temperature controller | Warner Instruments | TC-344C | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417-100TAB | |
EGTA | Sigma | 3780 | |
NH4Cl | Sigma | A0171 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
CaCl2*2H2O | Sigma | 223506 | |
MgCl2*6H2O | Sigma | M9272 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Paraformaldyhyde | Sigma | P6148 |