PI (4,5) P2 regulerer forskellige cellulære funktioner, men dens nanoskala organisation i cellen plasmamembranen er dårligt forstået. Ved mærkning PI (4,5) P2 med en tofarvet fluorescerende probe fusioneret til pleckstrin homologidomænet beskriver vi en ny tilgang til at studere PI (4,5) P2 rumlige fordeling i plasmamembranen på nanometerskala .
Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.
Phosphoinositider bidrager til en lille del af de samlede membranlipider, men spiller kritiske roller i en række forskellige cellulære processer. De omfatter syv medlemmer afledt af reversibel phosphorylering eller dephosphorylering af inositol ringe på 3., 4. og 5. position 1. Phosphatidylinositol 4-phosphat (PI4P) og phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PI (4,5) P2) er to vigtige phosphoinositider der fungerer relativt uafhængigt som de afgørende lipider af cellens plasmamembran (PM) 2,3. Phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) er meget mindre forekommende end PI4P og PI (4,5) P2, men det har unikke funktioner i forskellige cellulære processer, herunder cancer 4 og diabetes 5. Disse lipider har komplekse molekylære interaktioner med deres effektorer og mange andre proteiner. Derfor er det afgørende at forstå den rumlige organisering af disse phosphoinositides i PM på nanometer skala.
Montering beviser har vist, at protein komplekser eller molekyle klynger i de snævre PM områder kan fungere som signalering hotspots 6. For eksempel, syntaxin 1a, en nøgle protein, der regulerer membran fusion 7-9, viser klynge organisation i PM. Adskiller sig fra konsensus visning af klyngen organisation syntaxin 1a, den rumlige fordeling af phosphoinositider i PM er kontroversiel. PI (4,5) P2 distributionsmønstre spænder fra uniform 10-12, store pletter 13,14, til tætte klynger 14-18, afhængig af celletyper og eksperimentelle metoder. Den rumlige organisering af PI (4,5) P2 ved højere opløsning er også inkonsekvent. En undersøgelse ved hjælp stimuleret emission-depletion (STED) mikroskopi 19 har afsløret en lang række tætte PI (4,5) P 2 nano-klynger (~ 73 nm i diameter) i PM plader af PC-12 celler 20 </sop>. Dette resultat er forskelligt fra studier med anvendelse af hurtig nedfrysning elektronmikroskopi (EM) 21,22, en tilgang, der bevarer den intakte PM struktur af levende celler meget bedre end kemisk fiksering. Sidstnævnte viste særskilte puljer af PI (4,5) P2; forholdsvis koncentreret PI (4,5) P2 i caveolae og coatede gruber samt ensartet fordeling på den flade PM-regionen. Desuden kan nanoskala PI (4,5) P2 organisation i membranplader forskellige i levende og fikserede celler. Vores seneste arbejde undersøgte dette spørgsmål i både faste og lever INS-1 celler ved hjælp af single-molekyle lokalisering mikroskopi (SMLM) 23.
SMLM er baseret på stokastisk tændes kun en lille delmængde af fluoroforer på ethvert givet tidspunkt, således at individuelle fluoroforer kan lokaliseres med høj præcision. Der er udviklet mange super opløsning billedteknik anvendelse af lignende principper at overgå diffraktionsgrænsen af konventionel lysmikroskopi, sådans fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) 24, fluorescens fotoaktivering lokalisering mikroskopi (FPALM) 25, stokastisk optisk genopbygning mikroskopi (STORM) 26,27 og direkte STORM (dSTORM) 28. Med foto-omskiftelig eller fotoaktiverbare fluoroforer (farvestoffer eller fluorescerende proteiner), SMLM teknikker gør det muligt forskere til billedet biologiske strukturer på nanometer opløsning 24,29,30 med video-rate i levende celler 31,32.
Brug PI (4,5) P2 som et eksempel, vi introducerede SMLM tilgang til at studere nanoskala fordeling af phosphoinositider på PM. PH-domænet af PLCδ1 (phospholipase C δ1), der specifikt binder til PI (4,5) P2 er en veletableret probe til billeddannelse PI (4,5) P2 sub-cellulære fordeling og dynamik 33,34 i PM . Vi har genetisk mærkede dette domæne med to fluorescerende proteiner, PAmCherry1 35 og IRFP 36 </sup> til at producere en tofarvet fusionsproteinet (IRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (figur 1A-B). PAmCherry1 fungerer som fotoaktiverbare sonde af PH domæne til PALM og IRFP tjener som en generel indikator for at identificere transficerede celler før PALM erhvervelse . Vi anvender denne tofarvet fluorescerende probe til SMLM billeddannelse i de faste membran ark. For levende PALM billeddannelse, vi mærkede mEOS3 37 i stedet for PAmCherry1 til PH PLCδ1 domæne til at generere mEOS3.1-PH PLCδ1 probe for dens bedre foton effektivitet og lysstyrke (figur 1C-D).
SMLM billeddannelse med disse hidtil ukendte prober i PM til insulinproducerende INS-1-celler 38 har afdækket homogen mærkning af PI (4,5) P2 i størstedelen af PM regioner samt koncentreret PI (4,5) P2 mikrodomæner der er tyndt sammenblandet i den flade PM og nogle filopodia-lignende strukturer 23. Den nanoscale fordeling af PI (4,5) P2 tilvejebringer en strukturel basis for genopfinder hvordan den fungerer i levende celler.
For fejlfinding, to processer har brug for ekstra opmærksomhed: membran plader produktion og prøve fiksering. Som beskrevet i protokollen, inkubationstiden af dækglas i trin 1.1.6 er vigtigt for membran ark produktion. Optimal inkubationstid under vores eksperimentelle betingelse er 7-10 min (figur 2). Længere end 10 minutters inkubation vil producere intakte celler i stedet for membranbanerne på PDL dækglas og kortere inkubation vil føre til mindre eller ingen membran ark på PDL-overtrukne dækglas. Som beskrevet i protokollen, de fikseringsmidler og temperatur under fiksering er afgørende for at opretholde PI (4,5) P2 fordeling i PM. Fiksering ved RT eller brug af 4% -PFA alene kunne fordreje den normale lipid distribution i PM.
Ved at anvende PALM mikroskopi til membran lipid forskning, er vi i stand til at observere nanometer skala fordeling af PI (4,5) P2, en nøgle phosphoinositid der medierer meventuelle grundlæggende cellulære aktiviteter. Denne rumlige fordeling af PI (4,5) P2 med begrænsede koncentrationsgradienter i INS-1 celler giver en ramme for nytænkning lipid-protein interaktioner og lokale signalsystemer begivenheder PI (4,5) P2 i disse celler. Desuden kan de metoder, der er udviklet i dette arbejde også anvendes på andre membran phospholipid forskning med ordentlig sonder dermed tilbyde nye værktøjer til at studere phosphoinositider i biologiske processer.
Brugen af membran plader i dette arbejde omgår to store bekymringer i phospholipid morfologiske undersøgelser: vaskemiddel behandling og potentiel forurening signal fra cytosolen. Rengøringsmidler ofte forårsager klyngedannelse og betydelige tab af PM phospholipid signal. Forureningen af cytosolisk signal er særlig problematisk i tilfælde af lav hyppighed phosphoinositider på PM 23, såsom PI (3,4,5) P3 og PI (3,4) P2. Membranbane prøver er i stand til kredsløb;mvent disse problemer uden i væsentlig grad at forstyrre strukturer i forbindelse med plasmamembranen, såsom cortical actin meshwork og clathrin-overtrukne gruber 42,43. Den relative homogen fordeling af PI (4,5) P2 i PM er i god overensstemmelse med andre hurtig nedfrysning EM undersøgelser under anvendelse GST-PH PLC δ1 prober i fibroblast membranen 44.
Det er vigtigt at bemærke, at forkerte prøve forarbejdningsbetingelser kan generere misvisende resultater. Først er det vigtigt at udføre fikseringen trin ved en lavere temperatur (4 ° C) og bruge fiksativ GA for membran ark produktionslinje. Som vist i figur 3, varm temperatur og PFA fiksering uden GA er ikke tilstrækkelig til at løse phosphoinositider i celle PM. Dette kan fordreje den intakte PI (4,5) P2 fordeling og generere skarpe klynger, der ikke er observeret i levende celler under fysiologiske betingelser. For det andet er anvendelsen af PAmCherry1 somden SMLM sonde, snarere end andre sonder, er afgørende for kvantitativ PALM billeddannelse. Fordelen ved PAmCherry1 ansøgning kommer fra dets velkarakteriserede enkelt molekylære tilgængeligt-fysiske egenskaber 35,40,45, såsom lysstyrke, høj foto-aktivering effektivitet og mest af alt, meget begrænset foto-blinke. Disse egenskaber gør os i stand til at eliminere potentielle klynge artefakter fra foto-blinke og kvantitativt analysere molekylære tæthed af membran PI (4,5) P2.
Denne fremgangsmåde har også sine begrænsninger. Først kan membranen ark metode anvendt i denne undersøgelse ikke helt efterligne den fysiologiske fordeling af PI (4,5) P2 fordi cellen afbrydes før billeddannelse. Men vores live PALM imaging viser, ligner relativt homogen fordeling af PI (4,5) P2, støtter de observerede med membran ark prøver resultater. For det andet, som vi diskuterede i vores tidligere arbejde 23, SMLM kræver billedbehandling ekspertise og ekstra påtention at undgå imaging artefakter, der måtte opstå fra forskellige processer, herunder anvendte prober, prøveforberedelse og fiksering, billede prøvetagning og genopbygning. Endelig selvom PH-domænet baseret prober og antistoffer er blevet meget udbredt i phosphoinositid studier 46,47 det forbliver muligt, at ikke alle PI (4,5) P2 i membranen kan detekteres ved denne fremgangsmåde. For eksempel kan PI (4,5) P2 bundet af andre endogene proteiner ikke være tilgængelige for PH prober eller antistoffer, og dette kan medføre en undervurdering af PI (4,5) P2 på grund af den plads, hindring af sonden selv. En alternativ måde at mærkning PI (4,5) P2 ville bruge Top-Fluor PI (4,5) P2 48, en præ-mærket PI (4,5) P2-analog med en modificering på halen af originalen PI (4,5) P2. Imidlertid kan den omdannes hurtigt til andre phosphoinositid undertyper af hurtig levende cellemetabolisme siden dens inositol ring er den samme som endogenous PI (4,5) P2. Dette giver anledning til bekymring om, hvorvidt denne pre-mærket PI (4,5) P2 analog i levende celler trofast kan repræsentere PI (4,5) P2 snarere end dens stofskifteprodukter. På trods nogle begrænsninger, PH domæne baserede prober er stadig blandt de bedste sonder, der har været almindeligt anvendt til at overvåge PI (4,5) P2 fordeling og dynamik på PM af celler.
Den fremtidige anvendelse af denne metode kan udvides til andre phosphoinositid undersøgelser, såsom PI (3,4,5) P 3 og PI (3,4) P2. Sammenfattende den hidtil ukendte SMLM tilgang, der her åbner nye måder at studere phosphoinositid i celler. Anvendelse af PI (4,5) P2 som et eksempel, viser vi de unikke egenskaber af PALM billeddannelse i morfologiske og kvantitativ undersøgelse af cellemembran-molekyler, såvel som sine ulemper. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til andre molekyler af interesse og vil have brede applikationer i cellebiologi.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).
Microscope | Nikon | Ti-U | |
sCMOS camera | Andor | Neo | |
Spinning disk | Yokogawa | CSU X-1, 10,000 rpm | |
High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers. | Agilent | MLC400 | laser original powers & powers at the end of optical fiber) 405nm: 15 mW & 13 mW; 488nm: 45 mW & 42 mW; 561nm: 45 mW & 40 mW; 640nm: 35 mW & 16 mW. |
100X Objective | Nikon | APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm | |
Nikon acquisition and analysis software(NIS Element) | Nikon | ||
Matlab | MathWorks | ||
Coverslip | Warner | 64-0714 | Round 18mm coverslip, #1.5 |
Fibronectin | Millipore | FC010-5MG | |
Lipofectamin 3000(transfection reagent) | Invitrogen | L3000-008 | |
Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | #16120 | |
PI(4,5)P2 1st antibody | Santa Cruz | sc-53412 | |
secondary antibody F(ab’)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21237 | |
Tetraspeck beads | Invitrogen | T7279 | |
magnetic quick release imaging chamber | Warner Instruments | Cat#641994 | |
temperature controller | Warner Instruments | TC-344C | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417-100TAB | |
EGTA | Sigma | 3780 | |
NH4Cl | Sigma | A0171 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
CaCl2*2H2O | Sigma | 223506 | |
MgCl2*6H2O | Sigma | M9272 | |
Glucose | Sigma | G7021 | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Paraformaldyhyde | Sigma | P6148 |