Le interazioni RNA-proteina sono al centro di molti processi cellulari. Qui, descriviamo un metodo in vivo per isolare RNA specifico e identificare nuove proteine ad esso associate. Questo potrebbe gettare nuova luce su come gli RNA sono regolati nella cellula.
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Articolo metodologico
Novel RNA-Proteine leganti isolamento dalla rapida Metodologia
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le proteine leganti l'RNA (RBP) svolgono un ruolo importante in ogni aspetto del metabolismo e della regolazione dell'RNA. La loro identificazione è una sfida importante nella biologia moderna. Solo pochi metodi in vitro e in vivo consentono l'identificazione di RBP associate a un particolare mRNA bersaglio. Tuttavia, i loro principali limiti sono l'identificazione di RBP in un ambiente non cellulare (in vitro) o l'isolamento a bassa efficienza dell'RNA di interesse (in vivo). Una metodologia di purificazione e identificazione delle proteine leganti l'RNA (RaPID) è stata progettata per superare queste limitazioni nel lievito e consentire l'isolamento efficiente delle proteine associate in vivo. Per raggiungere questo obiettivo, l'RNA di interesse viene marcato con loop MS2 e co-espresso con una proteina di fusione di una proteina legante MS2 e una proteina legante la streptavidina (SBP). Le cellule vengono quindi sottoposte a reticolazione e lisata e i complessi vengono isolati attraverso perle di streptavidina. Le proteine che co-purificano con l'RNA marcato possono quindi essere determinate mediante spettrometria di massa. Recentemente abbiamo utilizzato questo protocollo per identificare nuove proteine associate all'mRNA PMP1 associato all'ER. Qui, forniamo un protocollo dettagliato di RaPID e discutiamo alcuni dei suoi limiti e vantaggi.
Introduzione
RNA-binding proteins (RBPs) rappresentano circa il 10% di S. proteine cerevisiae 1,2 e circa il 15% delle proteine di mammiferi 3-5. Essi sono implicati in molti processi cellulari, come l'elaborazione di mRNA post-trascrizionale e la regolamentazione, la traduzione, biogenesi dei ribosomi, tRNA aminoacilazione e la modifica, il rimodellamento della cromatina, e altro ancora. Un importante sottogruppo di RBPs è proteine mRNA-binding (mRNPs) 6,7. Nel corso di mRNA maturazione diversi RBPs legano la trascrizione e mediare la sua lavorazione nucleare, l'esportazione fuori dal nucleo, localizzazione cellulare, la....
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Protocollo
Nota: inserire una sequenza composta da 12 siti MS2-assorbente (MS2 loop; MS2L) nel locus genomico desiderato, di solito tra la griglia di lettura aperta (ORF) e il 3 'UTR. Un protocollo dettagliato per questa integrazione è fornito altrove 22. Verificare il corretto inserimento e di espressione mediante PCR, analisi Northern o RT-PCR 20,23. È importante verificare che l'integrazione non è intervenuto con la sintesi del 3'UTR. Inoltre, un plasmide esprimente MS2-CP fuso SBP sotto l'espressione di un promotore inducibile (esaurimento metionina) dovrebbe essere introdotto nelle cellule 24. Un ceppo identico, escluse le a....
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Risultati
RaPID consente l'isolamento di uno specifico RNA bersaglio con le sue proteine associate. Critico per il successo è mantenere l'RNA intatto il più possibile, ottenendo una quantità sufficiente di proteine. Per determinare l'efficienza di isolamento e la qualità dell'RNA, analisi Northern viene eseguita (Figura 1A). analisi Northern ha il vantaggio di segnalazione direttamente l'efficienza e la qualità della RaPID. Così, le quantità relative di lungh.......
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Discussione
Vari metodi utilizzano l'isolamento di mRNA specifici per identificare le loro proteine associate 11,34 35. Questi metodi si applicano in vitro e in vivo strategie per sondare le interazioni RNA-proteina. Metodi in vitro incubare esogena trascritti di RNA con lisato cellulare per catturare RBPs e isolare complessi RNP 36,37. Un approccio efficace di questo tipo è stato presentato di recente, che ha permesso l'identificazione di nuove proteine che legano.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Prof. Jeff Gerst e Boris Slobodin per la loro consigli utili nella creazione del protocollo di rapida e fornire i plasmidi necessari. Ringraziamo anche il Dott Avigail Atir-Lande per il suo aiuto nella creazione di questo protocollo e il dottor Tamar Ziv dalla Smoler Proteomica Centro per il suo aiuto con l'analisi LC-MS / MS. Ringraziamo il Prof. TG Kinzy (Rutgers) per l'anticorpo YEF3. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione 2.011.013 dalla Science Foundation binazionale.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tris | sigma | T1503 | |
| SDS | bio-lab | 1981232300 | |
| DTT | sigma | D9779 | |
| Fenolo acido (pH 4,3) | sigma | P4682 | |
| Fenolo acido: cloroformio (5:1, pH 4,3) | sigma | P1944 | |
| Cloroformio | bio-lab | 3080521 | |
| Formaldeide | Frutarom | 5551820 | |
| Glicina | Sigma | G7126 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 | |
| Eparina | Sigma | H3393 | |
| Fenilmetilsulfonile Fluoruro (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Leupeptina | Sigma | L2884 | |
| Aprotinina | Sigma | A1153 | |
| Inibitore della tripsina di soia | Sigma | T9003 | |
| Pepstatina | Sigma | P5318 | |
| DNasi I | Promega | M610A | |
| Ribonucleasi Inibitore | Takara | 2313A | |
| Perle di vetro | Sartorius | BBI-8541701 | 0,4-0,6 mm di diametro |
| Mini BeadBeater | BioSpec | Mini BeadBeater 16 | |
| Guanidinium | Sigma | G4505 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Perline di streptavidina | GE Healthcare | 17-5113-01 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A7906 | |
| TRNA di lievito | Sigma | R8508 | |
| Biotina | Sigma | B4501 | |
| Estratto di lievito | Bacto | 288620 | |
| peptone | Bacto | 211677 | |
| Glucosio | Sigma | G8270 | |
| 1x Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | |||
| 0,2 M NaOH | |||
| 4x Laemmli Sample Buffer (LSB) | 0,2 M Tris-HCL pH 6,8, 8% SDS, 0,4 M DTT, 40% glicerolo, 0,04% Bromofenolo-Blu. | ||
| lisi fenolica calda | 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM EDTA, 0,5% SDS | ||
| 3 M Acetato di sodio pH 5,2 | |||
| 100% e 70% Etanolo (EtOH) | |||
| Acqua | |||
| Tampone | 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,8 mM MgCl2, 0,5% NP-40, 5 mg/ml Eparina, 1 mM Ditiotreitolo (DTT), 1 mM Fenilmetilsulfonile Fluoruro (PMSF), 10 &; g/ml Leupeptina, 10 &; micro; g/ml Aprotinina, 10 µ g/ml Inibitore della tripsina di soia, 10 µ g/ml di pepstatina, 20 U/ml di DNasi I, 100 U/ml di ribonucleasi Inibitore. | ||
| di inversione reticolante | 100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 20 mM DTT, 2 % SDS. | ||
| RaPID tampone | 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 0,5% NP-40 | ||
| 0,5 M EDTA pH 8 | |||
| Silver Stain Plus Kit | Bio-Rad | 161-0449 | Per la rilevazione di proteine in gel di poliacrilammide |
| SD medium selettivo | 1,7 g/l di azoto base di lievito senza aminoacidi e solfato di ammonio, 5 g/l di solfato di ammonio, 2% di glucosio, 350 mg/l di treonina, 40 mg/l di metionina, 40 mg/l di adenina, 50 mg/l di lisina, 50 mg/l di triptofano, 20 mg/l di istidina, 80 mg/l di leucina, 30 mg/l di tirosina, 40 mg/l di arginina | ||
| Anti-eEF3 (EF3A, YEF3) | Regalo da Kinzy TG. (UMDNJ Robert Wood Johnson Medical School) | 1:5.000 | |
| Anticorpo anti GFP | Santa Cruz | sc-8334 | 1:3.000 |
| Anti coniglio IgG-HRP coniugato | SIGMA | A9169 | 1:10.000 |
Riferimenti
- Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6, e255(2008).
- Tsvetanova, N. G., Klass, D. M., Salzman, J., Brown, P. O.
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Ristampe e permessi
