"Phagosome Closure analysen" for å visualisere Phagosome Dannelse i tre dimensjoner ved hjelp av Total Internal Reflection Fluorescent Mikroskopi (TIRFM)
Summary
We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.
Abstract
Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation.
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.
Introduction
Fagocytose er en viktig cellefunksjon som starter med erkjennelsen og binding av materialet til overflaten reseptorer, noe som deretter fører til internalisering og nedbryting av inntatt materiale. Mens encellede eukaryoter som formen Dictyostelium discoideum og amøber bruke fagocytose for fôring på bakterier, har høyere organismer utviklet seg med profesjonelle celler. Makrofager eller dendrittiske celler er den første linjen i forsvaret mot patogener i ulike vev og organer, og er avgjørende for å aktivere det adaptive immunsystemet gjennom antigen presentasjon og cytokin produksjon 1-4. Under visse omstendigheter fagocytose kan utføres av ikke-profesjonelle fagocyttceller, f.eks, endotelceller og epitelceller. Denne prosessen er viktig for å opprettholde homeostase under utvikling og i voksen alder for normalt vev omsetning og ombygging. Til slutt, spesialiserte fagocytter som Sertoli celler i testikkel eller retinalpigment epitelceller er ekstremt potent fagocytter 5.
Dannelsen av en phagosome hvor degradering av mikroorganismer eller cellulært avfall oppstår starter med den gruppering av fagocyterende-reseptorer på overflaten av den fagocytisk cellen. Nedstrøms signale hendelser følgende gruppering av opsoniske reseptorer som Fc reseptorer (FcR) eller utfyller reseptorer (CRS) har blitt godt karakterisert. Men det er også mange ikke-opsoniske reseptorer inkludert Toll-lignende reseptorer (TLR), lektiner, mannosereseptorer og åtseldyr reseptorer. Disse reseptorene gjenkjenne determinanter på partikkeloverflaten som mannose eller fucose rester, fosfatidylserin og lipopolysakkarider 1,6-9.
Patogen eller cellerester erkjennelse innebærer å binde seg til og gruppering av flere typer fagocytisk-reseptoren, noe som deretter fører til intense og forbigående aktin ombygging. Parallelt samlings eksocytose av intracellulær compartments bidrar til frigjøring av membranen spenning og er viktig for effektiv fagocytose av store partikler. Signalerings hendelser som førte til aktin polymerisasjon og membran deformasjon ble dissekert i eksperimentelle modeller som utløste en enkelt phagocytic reseptor. Under FcR-mediert fagocytose, det er intens aktin polymerisasjon som reguleres av små GTPases (Rac, Cdc42). Blant deres nedstrøms effektorer, den Wiskott-Aldrich syndrom protein (WASP) fører til aktivering av Actin-Related Protein 2/3 kompleks (Arp2 / 3) som nucleates actin filamenter 1,2,4,10. Lokal produksjon av phosphatidylinositol-4, 5-bisfosfat (PI (4,5) P 2) er avgjørende for første aktin polymerisasjon som driver pseudopod formasjon. Konvertering til PI (3,4,5) P 3 kreves for pseudopod forlengelse og phagosome nedleggelse 11. Flere veier bidra til forsvinningen av PI (4,5) P-2. Først avløsning av phosphatidylinositol fosfat kinaSES (PIPKIs) fra phagosome arrestasjoner PI (4,5) P 2 syntese. For det andre kan det være fosforylert og forbrukes av klasse I PI3K kinaser (PI3K) og konverteres i PI (3,4,5) P 3 12. En rolle for fosfataser og fosfolipaser har også blitt antydet i PI (4,5) P a hydrolyse og F-aktin fjerning under fagocytose i pattedyrceller og i Dictyostelium 13,14. Fosfolipase C (PLC) δ hydrolyserer PI (4,5) P-2 til diacylglycerol og inositol-1,4,5- tris-fosfat. PI (4,5) P 2 og PI (3,4,5) P 3 fosfatase OCRL (oculo-cerebro-renalt syndrom av Lowe) har også vært innblandet i phagosome formasjon. Presis lokal dannelse av F-aktin, og dens depolymerisering er strengt regulert i rom og tid, og vi har vist at rekruttering av intracellulære kamre er viktig for å levere den lokalt OCRL fosfatase, og dermed bidra til lokal aktin depolymerisering ved bunnen av fagocytisk koppen <sup> 13,15. For dette har vi brukt eksperimentelle oppsettet er beskrevet her.
Spillerne mekanisme og molekylære som kreves for phagosome lukkemembran og spalting forblir dårlig definert på grunn av vanskelighetene med å visualisere og overvåke stedet for phagosome lukking. Inntil nylig var fagocytose observert på faste eller levende celler som internal partikler på sin rygg ansikt eller på sine sider, noe som gjør det betimelig visualisering av området av phagosome nedleggelse vanskelig. I tillegg kan festemetoder bevirke tilbaketrekking av membraner og vekte resultatene på pseudopodia forlengelse og lukking. I motsetning til analysen at vi har satt opp, og beskriver her tillater oss å visualisere pseudopod utvidelse og nedleggelse trinnet av fagocytose i levende celler 13, basert på total intern refleksjon mikroskopi (TIRFM) 16. Denne optiske teknikken bruker en flyktig bølge til å eksitere fluoroforer i et tynt område ved grenseflaten mellom et transparent sålokk (dekkglass) og en væske (cellekulturmedium). Tykkelsen av eksitasjon dybde er omkring 100 nm fra den faste overflate, slik at visualisering av molekylære hendelser nær plasmamembranen. TIRFM tillater et høyt signal-til-bakgrunnsforhold, og begrenser den ut-av-fokus fluorescens oppsamlet og den cytotoksisitet som følge av belysning av cellene.
Benytte seg av TIRFM, vi utviklet "phagosome nedleggelse analyse" der Dekk aktiveres med poly-lysin og deretter belagt med IgG-opsoniserte røde blodceller (IgG-SRBCs). Makrofager uttrykker transient fluorescens-merket proteiner av interesse er da lov til å sluke de IgG-SRBCs. Mens cellene løsner målt partikler som er ikke-kovalent bundet til glassoverflaten, kan tuppen av pseudopods observeres og registreres i TIRF modus. TIRF oppkjøp er kombinert med oppkjøp i epifluorescence modus etter skiftende scenen tre mikrometer ovenfor, som lar visualization av bunnen av fagocytisk koppen. Tilsetning av farmakologiske medikamenter slik som de som inhiberer aktin eller dynamin i løpet av prosessen er det også mulig ytterligere å dissekere prosessen på molekylært nivå.
Protokollen er beskrevet i detalj her er for en RAW264.7 muse-makrofag-cellelinjen og opsonisert partikler, men praktisk talt, kan det tilpasses en hvilken som helst annen celle fagocytisk og med andre mål som perler. Denne metoden vil gi bedre karakterisering av reguleringen i tid og rom av de molekylære aktørene som er involvert i pseudopod forlengelse og phagosome nedleggelse under ulike fagocyterende prosesser.
Protocol
Representative Results
Discussion
The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 °C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We notice…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nadège Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales” (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.
Materials
| Anti-sheep red blood cells IgG | MP Biomedicals | 55806 | |
| Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, ≥98% | Sigma | A7906 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cuvettes 4mm | Cell project | EP104 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fischer Scientific | 14190-094 | Room temperature |
| Electrobuffer kit | Cell project | EB110 | |
| 100mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| Gene X-cell pulser | Biorad | 165-2661 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1397 | |
| Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5 | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C Case | |
| iMIC | TILL Photonics | Oil-immersion objective (N 100x, NA1.49.), heating chamber with CO2, a camera single photon detection EMCCD ( Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens | |
| Poly-L-Lysine Solution 0.1% | Sigma | P8920-100ml | Dilution at 0.01% in water |
| RPMI 1640 medium GLUTAMAX Supplement | Life technologies | 61870-010 | |
| RPMI 1640 medium, no phenol red (10×500 ml) | Life technologies | 11835-105 | Warm in 37°C water bath before use |
| Sheep red blood cells (SRBCs) | Eurobio | DSGMTN00-0Q | Conserved in Alsever buffer at 4°C before use |
Riferimenti
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Ann Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
- Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 639-649 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Niedergang, F., Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. . Encyclopedia of Cell Biology. 2, 751-757 (2016).
- Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol. 14, 166-180 (2014).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat Rev Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu Rev Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Canton, J., Neculai, D., Grinstein, S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity. Nat Rev Immunol. 13, 621-634 (2013).
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262, 193-215 (2014).
- Scott, C. C., et al. Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate hydrolysis directs actin remodeling during phagocytosis. J Cell Biol. 169, 139-149 (2005).
- Schlam, D., et al. Phosphoinositide 3-kinase enables phagocytosis of large particles by terminating actin assembly through Rac/Cdc42 GTPase-activating proteins. Nat Commun. 6, 8623 (2015).
- Marion, S., et al. The NF-kappaB Signaling Protein Bcl10 Regulates Actin Dynamics by Controlling AP1 and OCRL-Bearing Vesicles. Dev Cell. 23, 954-967 (2012).
- Loovers, H. M., et al. Regulation of phagocytosis in Dictyostelium by the inositol 5-phosphatase OCRL homolog Dd5P4. Traffic. 8, 618-628 (2007).
- Deschamps, C., Echard, A., Niedergang, F. Phagocytosis and cytokinesis: do cells use common tools to cut and to eat? Highlights on common themes and differences. Traffic. 14, 355-364 (2013).
- Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. Chapter 12, Unit 12.29: Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events. Curr Protoc Cytom. , (2012).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Marie-Anais, F., Mazzolini, J., Herit, F., Niedergang, F. Dynamin-actin cross-talk contributes to phagosome formation and closure. Traffic. 17 (5), 487-499 (2016).
