JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

מי כלוריד-induced Ferric מודלים פקקת Murine

Published: September 05, 2016
doi:
10.3791/54479
, ,
1Department of Cellular and Molecular Medicine,Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2Department of Molecular Medicine,Cleveland Clinic Lerner College of Medicine of Case Western Reserve University, 3Department of Pharmacology,Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering,Case Western Reserve University

Summary

אנו מדווחים הליך מעודן של כלוריד Ferric (FeCl 3) מודלים פקקת -induced על העורק הראשי ואת mesenteric וכן וריד, מאופיין באמצעות מיקרוסקופ intravital ביעילות לפקח הזמן Occlusive היווצרות thrombi.

Abstract

Arterial thrombosis (blood clot) is a common complication of many systemic diseases associated with chronic inflammation, including atherosclerosis, diabetes, obesity, cancer and chronic autoimmune rheumatologic disorders. Thrombi are the cause of most heart attacks, strokes and extremity loss, making thrombosis an extremely important public health problem. Since these thrombi stem from inappropriate platelet activation and subsequent coagulation, targeting these systems therapeutically has important clinical significance for developing safer treatments. Due to the complexities of the hemostatic system, in vitro experiments cannot replicate the blood-to-vessel wall interactions; therefore, in vivo studies are critical to understand pathological mechanisms of thrombus formation. To this end, various thrombosis models have been developed in mice. Among them, ferric chloride (FeCl3) induced vascular injury is a widely used model of occlusive thrombosis that reports platelet activation and aggregation in the context of an aseptic closed vascular system. This model is based on redox-induced endothelial cell injury, which is simple and sensitive to both anticoagulant and anti-platelets drugs. The time required for the development of a thrombus that occludes blood flow gives a quantitative measure of vascular injury, platelet activation and aggregation that is relevant to thrombotic diseases. We have significantly refined this FeCl3-induced vascular thrombosis model, which makes the data highly reproducible with minimal variation. Here we describe the model and present representative data from several experimental set-ups that demonstrate the utility of this model in thrombosis research.

Introduction

פקקת עורקים (קריש דם) היא סיבוך נפוץ של מחלות מערכתיות רבות הקשורות בדלקת כרונית, כולל טרשת עורקים, סוכרת, השמנת יתר, סרטן והפרעות rheumatologic אוטואימונית כרונית. Thrombi המתרחשת בגזע במחזור עורקים מהפעלת טסיות הולמת, צבירה ומנגנוני coagulatory הבאות שלה מעורבת התקף לב, שבץ ואובדן גפיים. בדפנות כלי הדם היא מערכת מורכבת הכוללת סוגי תאים מרובים ומושפע רב של גורמים חיצוניים כולל מאמץ הגזירה, תאי דם, הורמונים וציטוקינים, כמו גם ביטוי של חלבונים נוגדי חמצון בדפנות כלי הדם. ניסויים במבחנה לא יכול לשכפל בסביבה המורכבת הזו ולכן במחקרים vivo תוך שימוש במודלים של בעלי חיים הם קריטיים כדי לאפשר הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים הפרעות של פקקת.

עכברים הוכחו יש simמנגנוני ilar לבני אדם במונחים של פקקת, טרשת עורקים, דלקת 1,2 סוכרת. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים ו בנוקאאוט ניתן ליצור לבדוק את הפונקציה של מוצרים גנים ספציפיים פיזיולוגי מורכב או הסביבה פתולוגיים. מחקרים כאלה לחקות הפתולוגיה האנושית עשויה לספק מידע מכניסטית חשובים הקשורים גילוי מסלולים וטיפולים חדשים, כמו גם לספק פרטים חשובים באפיון השפעות התרופה על פקקת.

Thrombi עורקי הפתולוגי להתרחש עקב אנדותל פציעה שכבה או תפקוד לקוי וחשיפה של זרם הדם המטריצה ​​subendothelial 3,4. מודלים פקקת שונים פותחו כדי לגרום נזק האנדותל זה כגון פגיעה מכנית, מתחם photoreactive פציעה חמצוני מבוססי בנגל רוז לייזר פציעה 5. ב הספקטרום הזה, כלוריד Ferric (FeCl 3) -induced לפגיעה בכלי דם היא מודל נפוץ של פקק. מגיב זה כאשרמוחל על היבט של כלי החיצוני גורם נזק חמצוני לתאים וסקולרית 6-8, עם הפסד של הגנה תא האנדותל מן במחזור טסיות ורכיבים של מפל הקרישה. המודל 3 FeCl הוא פשוט רגיש לשני תרופות נוגדות קרישה ואנטי-טסיות, והועלה על התרדמה ועורקים הירך, ורידי הצוואר, mesenteric ו arterioles cremasteric ו venules בעכברים, חולדות, שרקנים וארנבות 6-15.

אחת פרמטר מדיד במודל זה הוא הזמן שחלף מפציעה להשלים חסימה כלי, כפי שנמדד הפסקת זרימת הדם עם מד זרימת דופלר או בהשגחה ישירה עם 6,7,9 מיקרוסקופיה intravital. מגוון של פעמים בין 5 עד 30 דקות דווח במחקרים שונים C57BL6 עכברי 7-10,16, דבר המצביע על כך ריכוזי FeCl 3, סוגים של הרדמה, טכניקות כירורגיות, גיל עכבר, רקע גנטי, שיטת המדידה בזרימת lood, ומשתנים סביבתיים אחרים יש השפעה משמעותית במודל זה. השתנות רחבה זה עושה את זה קשה להשוות מחקרים מקבוצות מחקר שונות והוא רשאי להתקין זיהוי של הבדלים דקים קשה.

עם חזון כדי למזער variabilities כאלה ולהקים לשחזור אחיד במערכת מודל vivo, יש לנו מודל חלופי שהוצע עורק התרדמה -induced FeCl 3 שעושה את הנתונים לשחזור ביותר עם ​​וריאציה מינימלי 6-10,16-19. במאמר זה נתאר ולשתף את הכישורים ולדווח כמה דוגמאות ניסיוני נציג שיכול להפיק תועלת במודל זה.

Protocol

כל הנהלים והמניפולציות של חיות אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדות שימוש (IACUC) של קליבלנד קליניק בהתאם למדיניות השירות לבריאות ציבור ארצות הברית על הטיפול האנושי ושימוש בחיות, ואת מדריך NIH עבור הטיפול ושימוש בחיות מעבדה. <p class="jove_title" style=";text-align:right;direc…

Representative Results

התרדמה עורקים פקקת דגם בעכברים עם רקע C57BL6, אנו ממליצים להשתמש 7.5% FeCl 3 לטיפול הספינה דקות 1 כנקודת מוצא. תחת טיפול של 7.5% 3 FeCl, גבולות האזור הפצוע בדפנות כלי דם נורמליות מזוהים בקלות תחת מיקרוסקופ (מקוון ראו וידאו 1),<…

Discussion

מודל FeCl 3 -induced הוא אחד הדגמים פקקו בשימוש הנרחב ביותר, אשר לא יכול רק לספק מידע רב ערך על שינויים גנטיים על תפקוד טסיות ופקק 7,8,16,19,31-33, אבל גם יכול להיות כלי רב ערך להערכת תרכובות אסטרטגיות טיפוליות לטיפול ומניעה של מחלות atherothrombotic 11,17,34-37. כאן אנו הראינו…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) of the National Institutes of Health under award numbers R01 HL121212 (PI: Sen Gupta), R01 HL129179 (PI: Sen Gupta, Co-I: Li) and R01 HL098217 (PI: Nieman). The content of this publication is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Materials

Surgical Scissors – Tungsten Carbide Fine Science Tools  14502-14 cut and hold skin
Micro-Adson Forceps – Serrated/Straight/12cm Fine Science Tools  11018-12 cut and hold skin
Metzenbaum Fino Scissors – Tungsten Carbide/Curved/Blunt-Blunt/14.5cm Fine Science Tools  14519-14   to dissect and separate soft tissue
Ultra Fine Hemostat – Smooth/Curved/12.5cm Fine Science Tools  13021-12 to dissect and separate soft tissue
Graefe Forceps – Serrated/Straight/10cm Fine Science Tools  11050-10 to dissect and separate soft tissue
Dumont #5 Fine Forceps – Biology Tips/Straight/Inox/11cm Fine Science Tools  11254-20  Isolate vessel from surounding tissue
Dumont #5XL Forceps – Standard Tips/Straight/Inox/15cm Fine Science Tools  11253-10 Isolate vessel from surounding tissue
Blunt Hook- 12cm/0.3mm Tip Diameter Fine Science Tools  10062-12 Isolate vessel from surounding tissue
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools  12061-02 Needle holders
Suture Thread 4-0 Fine Science Tools  18020-40 For fix the incisors to the plate
Suture Thread 6-0 Fine Science Tools  18020-60 For all surgery and ligation
Kalt Suture Needles Fine Science Tools  12050-03
rhodamine 6G  Sigma 83697-1G To lebel platelets
FeCl3 (Anhydrous) Sigma 12321 To induce vessel injury
Papaverine hydrochloride Sigma P3510 To inhibit gut peristalsis.
Medline Surgical Instrument Sterilization Steam Autoclave Tapes Medline 111625 To fix the mouse to the plate
Fisherbrand™ Syringe Filters – Sterile 0.22µm Fisher 09-720-004 For sterlization of solutions injected to mice
Fisherbrand™ Syringe Filters – Sterile 0.45µm Fisher 09-719D To filter the FeCl3 solution
Sterile Alcohol Prep Pad Fisher 06-669-62 To sterilize the surgical site
Agarose  BioExpress E-3120-500 To make gel stage
Leica DMLFS fluorescent microscope Leica Intravital microscope
GIBRALTAR Platform and X-Y Stage System npi electronic GmbH http://www.npielectronic.de/products/micropositioners/burleigh/gibraltar.html
Streampix version 3.17.2 software NorPix https://www.norpix.com/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Sachs, U. J., Nieswandt, B. In vivo thrombus formation in murine models. Circ Res. 100, 979-991 (2007).
  2. Libby, P., Lichtman, A. H., Hansson, G. K. Immune effector mechanisms implicated in atherosclerosis: from mice to humans. Immunity. 38, 1092-1104 (2013).
  3. Ruggeri, Z. M. Platelet adhesion under flow. Microcirculation. 16, 58-83 (2009).
  4. Watson, S. P. Platelet activation by extracellular matrix proteins in haemostasis and thrombosis. Curr Pharm Des. 15, 1358-1372 (2009).
  5. Furie, B., Furie, B. C. Thrombus formation in vivo. J Clin Invest. 115, 3355-3362 (2005).
  6. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biol. 1, 50-55 (2013).
  7. Ghosh, A., et al. Platelet CD36 mediates interactions with endothelial cell-derived microparticles and contributes to thrombosis in mice. J Clin Invest. 118, 1934-1943 (2008).
  8. Chen, K., et al. Vav guanine nucleotide exchange factors link hyperlipidemia and a prothrombotic state. Blood. , (2011).
  9. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  10. Chen, K., Febbraio, M., Li, W., Silverstein, R. L. A specific CD36-dependent signaling pathway is required for platelet activation by oxidized low-density lipoprotein. Circ Res. 102, 1512-1519 (2008).
  11. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thromb Res. 60, 269-280 (1990).
  12. Konstantinides, S., Schafer, K., Thinnes, T., Loskutoff, D. J. Plasminogen activator inhibitor-1 and its cofactor vitronectin stabilize arterial thrombi after vascular injury in mice. Circulation. 103, 576-583 (2001).
  13. Leadley, R. J., et al. Pharmacodynamic activity and antithrombotic efficacy of RPR120844, a novel inhibitor of coagulation factor Xa. J Cardiovasc Pharmacol. 34, 791-799 (1999).
  14. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thromb Haemost. 79, 656-662 (1998).
  15. Farrehi, P. M., Ozaki, C. K., Carmeliet, P., Fay, W. P. Regulation of arterial thrombolysis by plasminogen activator inhibitor-1 in mice. Circulation. 97, 1002-1008 (1998).
  16. Robertson, J. O., Li, W., Silverstein, R. L., Topol, E. J., Smith, J. D. Deficiency of LRP8 in mice is associated with altered platelet function and prolonged time for in vivo thrombosis. Thromb Res. 123, 644-652 (2009).
  17. Gupta, N., Li, W., Willard, B., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Proteasome proteolysis supports stimulated platelet function and thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 160-168 (2014).
  18. Srikanthan, S., Li, W., Silverstein, R. L., McIntyre, T. M. Exosome poly-ubiquitin inhibits platelet activation, downregulates CD36 and inhibits pro-atherothombotic cellular functions. J Thromb Haemost. 12, 1906-1917 (2014).
  19. Li, W., et al. Thymidine phosphorylase participates in platelet signaling and promotes thrombosis. Circ Res. 115, 997-1006 (2014).
  20. Le Menn, R., Bara, L., Samama, M. Ultrastructure of a model of thrombogenesis induced by mechanical injury. J Submicrosc Cytol. 13, 537-549 (1981).
  21. Li, W., et al. CD36 participates in a signaling pathway that regulates ROS formation in murine VSMCs. J Clin Invest. 120, 3996-4006 (2010).
  22. Re-examining Acute Eligibility for Thrombolysis Task Force. Review, historical context, and clarifications of the NINDS rt-PA stroke trials exclusion criteria: Part 1: rapidly improving stroke symptoms. Stroke. 44, 2500-2505 (2013).
  23. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Arachiche, A., Wahl, J. K., Nieman, M. T. Development and characterization of monoclonal antibodies against Protease Activated Receptor 4 (PAR4). Thromb Res. 135, 1165-1171 (2015).
  24. Mumaw, M. M., de la Fuente, M., Noble, D. N., Nieman, M. T. Targeting the anionic region of human protease-activated receptor 4 inhibits platelet aggregation and thrombosis without interfering with hemostasis. J Thromb Haemost. 12, 1331-1341 (2014).
  25. Modery-Pawlowski, C. L., Kuo, H. H., Baldwin, W. M., Sen Gupta, A. A platelet-inspired paradigm for nanomedicine targeted to multiple diseases. Nanomedicine (Lond). 8, 1709-1727 (2013).
  26. Anselmo, A. C., et al. Platelet-like nanoparticles: mimicking shape, flexibility, and surface biology of platelets to target vascular injuries. ACS Nano. 8, 11243-11253 (2014).
  27. Modery, C. L., et al. Heteromultivalent liposomal nanoconstructs for enhanced targeting and shear-stable binding to active platelets for site-selective vascular drug delivery. Biomaterials. 32, 9504-9514 (2011).
  28. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. J Biol Chem. 284, 13110-13118 (2009).
  29. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126, 817-824 (2015).
  30. Barr, J. D., Chauhan, A. K., Schaeffer, G. V., Hansen, J. K., Motto, D. G. Red blood cells mediate the onset of thrombosis in the ferric chloride murine model. Blood. 121, 3733-3741 (2013).
  31. Dunne, E., et al. Cadherin 6 has a functional role in platelet aggregation and thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, 1724-1731 (2012).
  32. Lockyer, S., et al. GPVI-deficient mice lack collagen responses and are protected against experimentally induced pulmonary thromboembolism. Thromb Res. 118, 371-380 (2006).
  33. Zhou, J., et al. The C-terminal CGHC motif of protein disulfide isomerase supports thrombosis. J Clin Invest. , (2015).
  34. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 9, 779-789 (2011).
  35. Day, S. M., Reeve, J. L., Myers, D. D., Fay, W. P. Murine thrombosis models. Thromb Haemost. 92, 486-494 (2004).
  36. Cooley, B. C. Murine models of thrombosis. Thromb Res. 129 Suppl 2, S62-S64 (2012).
  37. Gupta, N., Li, W., McIntyre, T. M. Deubiquitinases Modulate Platelet Proteome Ubiquitination, Aggregation, and Thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 35, 2657-2666 (2015).
  38. Konstantinides, S., et al. Distinct antithrombotic consequences of platelet glycoprotein Ibalpha and VI deficiency in a mouse model of arterial thrombosis. J Thromb Haemost. 4, 2014-2021 (2006).
  39. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93, 327-358 (2013).
  40. Yan, S. F., Mackman, N., Kisiel, W., Stern, D. M., Pinsky, D. J. Hypoxia/Hypoxemia-Induced activation of the procoagulant pathways and the pathogenesis of ischemia-associated thrombosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, 2029-2035 (1999).
  41. Rahaman, S. O., Li, W., Silverstein, R. L. Vav Guanine nucleotide exchange factors regulate atherosclerotic lesion development in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, 2053-2057 (2013).
  42. Silverstein, R. L., Li, W., Park, Y. M., Rahaman, S. O. Mechanisms of cell signaling by the scavenger receptor CD36: implications in atherosclerosis and thrombosis. Trans Am Clin Climatol Assoc. 121, 206-220 (2010).
  43. Liu, J., Li, W., Chen, R., McIntyre, T. M. Circulating biologically active oxidized phospholipids show on-going and increased oxidative stress in older male mice. Redox Biol. 1, 110-114 (2013).

Tags

Ferric Chloride-induced ThrombosisMouse Carotid Artery ModelIntravital MicroscopyPlatelet ActivationThrombosisAnticoagulantAntiplatelet DrugsPathophysiology Of ThrombosisNovel DrugsTargeted NanomedicineFur RemovalSurgical IncisionJugular Vein DissectionRhodamine 6G Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric Chloride-induced Murine Thrombosis Models. J. Vis. Exp. (115), e54479, doi:10.3791/54479 (2016).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image