We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.
På trods af den regenerative kapacitet skeletmuskulatur, permanente funktionelle og / eller kosmetiske underskud (f.eks volumetrisk muskeltab (VML) fra traumatisk skade, sygdom og forskellige medfødte, genetiske og erhvervede tilstande er ret almindelige. Tissue engineering og regenerativ medicin teknologier har et enormt potentiale til at tilvejebringe en terapeutisk løsning. imidlertid udnyttelse af biologisk relevante dyremodeller i kombination med langsgående vurderinger af relevante funktionelle foranstaltninger er kritisk for udviklingen af forbedrede regenerative terapeutiske midler til behandling af VML-lignende skader. i denne forbindelse en kommerciel muskel vægtstangssystem kan anvendes til at måle længden, spænding, kraft og hastighed parametre i skeletmuskulatur. Vi anvendte dette system, sammen med en stærk, tofaset stimulator, at måle in vivo kraft produktion som respons på aktivering af den forreste crural rum i rotte bagben. Vi har PREVIgere brugt dette udstyr til at vurdere den funktionelle konsekvenser af VML skade på tibialis anterior (TA) muskel, samt omfanget af funktionel genopretning efter behandling af de sårede TA musklen med vores manipuleret væv muskel reparation (TEMR) teknologi. For sådanne undersøgelser, er den venstre fod af en bedøvet rotte forsvarligt forankret til en fodplade forbundet med en servomotor, og den fælles peronealnerve stimuleres af to perkutane nåleelektroder til at fremkalde muskelkontraktion og dorsiflexion af foden. Den peronealnerve stimulation-induceret muskelsammentrækning måles over en vifte af stimulation frekvenser (1-200 Hz), for at sikre en eventuel plateau i kraft produktion, der giver mulighed for en nøjagtig bestemmelse af peak tetanic kraft. Samt vurdering af omfanget af VML skade samt graden af funktionel bedring efter behandling, kan denne metode let anvendes til at studere diverse aspekter af muskel fysiologiske og patofysiologiske. En sådan fremgangsmåde shoULD hjælpe med en mere rationel udvikling af forbedrede lægemidler for muskel reparation og regeneration.
Skeletal muscle har en bemærkelsesværdig iboende kapacitet til reparation i respons på skade eller sygdom 1,2. Eksperimentelt robustheden af denne regenerative reaktion er veldokumenteret i dyremodeller ved at studere, fx tidsforløbet for skeletmuskel skader, reparation og regenerering efter anvendelse af myotoxins (f.eks cardiotoxin) 3-7. Mere specifikt efter omfattende cardiotoxin-induceret muskelskader (38-67% af muskelfibre 8), er regenerering medieret af satellit celler, bosat stamceller, der modnes i sidste ende blive funktionelle muskelfibre 4,9-13. Slutresultatet er forøget efter skade funktionel regenerering af sunde, force-producerende muskelvæv 14-16. Selvom detaljerne er godt uden for rammerne af denne rapport, det mekanistiske grundlag for muskel regenerering afspejler de omhyggeligt orkestreret begivenheder talrige celletyper fra flere slægter udnytte canonical signaleringsforløb kritisk for både vævsudvikling og morfogenese 5,17-21. Vigtigt er myotoxin-induceret regenerering aktiveret af, at den ekstracellulære matrix, neuronal innervation og blodkar perfusion forbliver strukturelt intakt efter cardiotoxin-induceret muskelskade 3,8,22. I stærk kontrast, disse centrale vævsstrukturer og komponenter er per definition helt fraværende i forbindelse med VML skade; hvor frank tab af væv på grund af en række årsager, resulterer i vedvarende funktionelle og kosmetiske mangler 23-25.
Uanset de ekstra udfordringer forbundet med muskel reparation og regeneration efter VML skade sammenlignet med myotoxin-induceret muskelskade, forbedret forståelse af det mekanistiske grundlag for skeletmuskulatur regenerering og reparation, i mange forskellige sammenhænge, ville være godt tjent med udnyttelse af biologisk relevante dyremodeller i kombination med langsgående enssessments af relevante funktionelle foranstaltninger. Som omtalt heri, undersøgelser af rotte bagben giver en fremragende model-system til dette formål. Mere specifikt musklerne i den forreste crural rum (tibialis anterior, extensor digitorum longus (EDL) og hallicus longus (HL)), der er ansvarlige for dorsiflexion af foden, identificeres let og manipuleret. Desuden er de tjent med de store blodkar (iliaca og brancher), og er innerverede af nerver (ischiadicus og grene, herunder Peroneal) kører længden af benet 26-28. Som sådan kan man anvende rotte bagben model til direkte vurdere skeletalmuskelfunktion / patologi in vivo, eller at vurdere mere indirekte virkning af patologi-relaterede ændringer i blodkar eller nerver på tilsvarende skeletmuskel funktion. I begge scenario kan sygdommens alvorlighed, samt behandlingens effektivitet bestemmes som en funktion af muskelkraft produktion (moment) og tilsvarende fod movement 29-34.
Ideelt set er kraftmålinger ledsaget af histologiske undersøgelser og genekspression analyser nøjere vurdere den strukturelle og molekylære status skeletmuskel. Grundlæggende histologi og immunhistokemi, for eksempel, er i stand til at besvare spørgsmål om muskel størrelse, muskelfibrene alignment, ekstracellulær matrix sammensætning, placering af kerner, celleantal, og proteinlokalisering. Genanalyse, til gengæld er nødvendige for at identificere de molekylære mekanismer, der kan påvirke / modulerer løbetiden af muskelfibre, sygdomstilstande og metabolisk aktivitet. Mens disse metoder giver afgørende oplysninger, de generelt repræsenterer terminal endpoints, og vigtigst af alt, de ikke direkte fat på funktionsevne af skeletmuskulatur, og dermed er korrelativ snarere end forårsagende. Men når histologiske undersøgelser og genekspression analyser evalueres i forbindelse med funktionel measures, da mekanismerne i kraft produktion og funktionel regenerering kan mest præcist identificeret.
I denne henseende kan den kraft, som frembringer evner af en muskel kan måles in vitro, in situ eller in vivo. Alle tre metoder har både fordele og begrænsninger. I et in vitro eksperiment, for eksempel musklen er fuldstændig isoleret og fjernet fra kroppen af dyret. Ved at fjerne de påvirkninger af blodkar og nerver, der forsyner den muskel, kan bestemmes kontraktile evne af vævet i en tæt kontrolleret ydre miljø 35. In situ muskel test tillader musklen, der skal isoleres, som med in vitro præparater imidlertid , innervation og blodforsyning forbliver intakt. Fordelen ved in situ eksperimentelle model er, at det tillader en person muskel, der skal undersøges, mens innervation og blodforsyningen er minimalt forstyrres 36. I beggein vitro og in situ forsøg kan farmakologiske behandlinger anvendes mere direkte uden at skulle redegøre for virkningerne af eventuelle omkringliggende væv eller virkningen af kredsløbssygdomme på de målte kontraktile respons 37. Men in vivo funktion testning, som beskrevet heri, er den mindst invasive teknik til evaluering muskelfunktionen hos dets native miljø 38, og kan udføres gentagne gange over tid (dvs. i længderetningen). Som sådan vil det være omdrejningspunktet for diskussionen nedenfor.
I denne henseende perkutane elektroder indsat nær musklen af interesse, eller den motoriske nerve, der tjener det, tilvejebringe et elektrisk signal til musklen. En transducer måler derefter de resulterende ændringer længde eller kraft i den aktiverede muskler som anvist af en forudbestemt, tilpasset software-protokol. Ud fra disse data kan bestemmes de fysiske egenskaber af musklen. Disse indbefatter force-frekvens, maksimal stivkrampe, force-hastighed, stivhed, længde spændinger og træthed. Muskel længde eller kraft kan også holdes konstant, således at musklen kontrakter isometrisk eller isotonisk. Vigtigt er det, kan disse eksperimentelle protokoller hurtigt udført, let gentaget, og customized- alt imens dyret bedøvet og med et opsving periode på timer til dage. Et enkelt dyr kan undergå in vivo kraft teste flere gange, således at langsgående studier af sygdomsmodeller eller evaluering af terapeutiske platforme / teknologier.
Som beskrevet heri, et kommercielt muskel vægtstangssystem sammen med en stærk, er bi-fase stimulator anvendes til at udføre in vivo muskelfunktion test for at vurdere bidraget af tibialis anterior muskel i rotte bagben til dorsalfleksion af foden via stimulering af den peronealnerve. Vi har udviklet en protokol, der er specielt designet til at evaluere regenerativ medicin / tissue engineering teknologier til muskel reparation efter traumatisk VML skade af rotte TA musklen. Det bør noteres; EDL og HL skal dissekeres ud af den forreste crural cockpittet for at specifikt evaluere TA musklen (de udgør ca. 15-20% af den samlede tibialis anterior drejningsmoment målt efter peronealnerve stimulation (Corona et al., 2013) ). Fordi denne fremgangsmåde indeholder omfattende langsgående analyse af muskel fysiologi / funktion, kan det kaste vigtigt mekanistisk indsigt i en lang række andre typer af fysiologiske undersøgelser samt en bred vifte af sygdom eller terapeutiske områder 39. For eksempel in vivo muskelfunktion test er gældende for studier af motion fysiologi, iskæmi / reperfusion forskning, myopati, nerveskader / neuropati og vasculopati, sarcopeni og muskeldystrofier 40.
Denne protokol viser en forholdsvis enkel fremgangsmåde til udførelse af in vivo muskelfunktion test på den forreste crural rum af rotte bagben. Andre former for muskelfunktion test, herunder ex vivo og in situ-protokoller, kan også give vigtige oplysninger om muskel fysiologi. Men betydningen af in vivo funktionstest ligger i sin invasiv karakter, og den kendsgerning, at det mest præcist rekapitulerer endogene mekanismer muskelstimulation. For både ex vivo og in situ test, senen og / eller muskler er udsat for, og derfor skal holdes fugtig eller neddykket 41,42. In vivo-undersøgelse fjerner forstyrrende variabler af traumer og betændelse, der kan være forårsaget af de kirurgiske procedurer, der kræves til in situ muskelfunktion test; dette er især vigtigt, hvis målet om forsøget er at undersøge inflammatoriske og cellulære processer <sop> 43. Endvidere in vivo-forsøg kræver lidt kirurgisk dygtighed som musklen ikke er isoleret fra sine omgivelser og ikke kræver præcise knob at reducere muskel / sene glidning (som det er tilfældet for in situ eller ex vivo-test) 41. Desuden med tilstrækkelig praksis, hastigheden af korrekt elektrodeplacering og evnen til hurtigt at foretage justeringer for at opnå maksimal kraft produktion af musklen vil sikre, at protokollen færdiggørelse er hurtig og reproducible- både inden dyr og på tværs af forskellige brugere af det samme udstyr 39 . Det er gavnligt at begynde med en vurdering af hele forreste crural komponent som illustreret, før udskæring af mindre tilgængelige synergistiske muskler (EDL og HL) for mere direkte undersøgelse af TA musklen. Ved anvendelse af denne fremgangsmåde, kan man forholdsvis hurtigt opnå beherskelse af teknikken. Mens den her beskrevne procedure demonstrerer og understreger nytten af en kraft frequency protokollen til at fremkalde stivkrampe og bestemme den maksimale kraft der produceres af en muskel, skal brugerne bestemme, hvilken type (r) af funktionelle test, der bedst informere deres specifikke eksperiment (r) og forskningsmæssige mål.
Der er flere kritiske trin, der bør omhyggeligt udføres for at sikre optimale og reproducerbare eksperimentelle resultater, det vil sige sammenhængende maksimal kraft produktion af musklen til forskellige stimulationsparametre. Flere af de vigtigste funktioner er skitseret i figur 2. Men korrekt placering og stabilitet af stimulerende elektrode er en absolut forudsætning for reproducerbar maksimal stimulation af peronealnerve. I denne henseende bør elektroderne placeres overfladisk. Det vil sige, hvis elektroden placering er for dybt, risikerer man direkte elektrisk stimulation af antagonistmuskler og dermed formindske størrelsen af den observerede kontraktile respons af den forreste crural rum. Endvidereto elektroder skal placeres så tæt på hinanden som muligt for at reducere den elektriske modstand af den omgivende hud og bindevæv. Generelt elektrode positionering tæt til knæet og medialt til benet direkte opsporing kanten af tibialis anterior, hvor den møder gastrocnemius giver ofte tilstrækkelig produktion kraft. Dette sikrer også, at elektroderne er anbragt tilstødende og vinkelret på planet af den peronealnerve, som igen, er vinkelret på skinneben og sideværts ned i benet fra knæet. Men den naturlige variation i anatomi mellem dyr kræver konstant årvågenhed for at sikre, at elektrode placering er optimeret fra sag til sag. Som sådan er der en vis grad af forsøg og fejl i forbindelse med elektrodeplacering, der er kraftigt formindsket af erfaringerne fra brugeren. Det antal gange elektroderne gennembore huden bør minimeres for at reducere hævelse og inflammation, hvilket nedsætter migasured kraft produktion. Det afhænger af, hvor nålene er oprindeligt placeret, men det anbefales at bevæge nålene to gange eller mindre især i området omkring knæskallen. Endelig, når elektroderne er anbragt i benet af dyret, mindre justeringer kan foretages til placeringen af benet og den afgivne strøm gennem elektroderne. Dette bør ske samtidig overvåge kraft, der frembringes fra en enkelt spjæt. Foruden elektrode placering, kan justeringer også foretages til den spænding leveret over elektroderne. Men i opsætningen her beskrevne, er det vigtigt at være forsigtig, når at øge spændingen som en måde at øge kraft output, fordi den øgede spænding vil stimulere de nerver, der innerverer antagonist muskler.
Der er tre vigtige tekniske bekymringer, der skal overvåges for at sikre, at elektroden placering forbliver optimal. For det første skal foden af bedøvede dyr være solidtforankret til fodpedal apparat, som måler den muskelkraft produktion (figur 2). Hvis foden ikke er sikkert forankret kan den sande kraft frembragt af musklen være ufuldstændigt oversat til krafttransducer. Ustabil fod fiksering introducerer også risikoen for at miste den optimale placering af elektroderne som bevægelse ud over normal muskelsammentrækning (dvs. foden bevæger sig væk fra fodpladen) kan medføre forskydning af elektroderne fra deres overfladiske position eller fordrive dem helt. Enten scenario vil falde den målte kraft. For det andet bør dyrets krop være helt liggende og på linie i en lige plan (figur 2). Korrekt positionering af dyr krop forhindrer små bevægelser af benet på grund af respiration, og også minimerer vridning af benet og bækkenet, muliggør en bedre placering og stadig kontakt af de stimulerende elektroder. Tredje, korrekt placering og forankring af knæet er critical at sikre, at benet forbliver stabil, og således, hjælper med at stabilisere den optimale placering af de stimulerende elektroder for at tillade konsistent aktivering af peronealnerve.
Der er et par yderligere punkter, som bør fremhæves. Først er det kommercielle muskel løftestang system designet til at udføre test på venstre ben, men opsætningen kan modificeres til at udføre test på det højre ben samt. For det andet kan muskel håndtag systemer vælges baseret på størrelsen af dyret, så brugerne skal sikre, at platformen anvendt, er tilstrækkelig til at måle og støtte kraft frembragt af dyremodel for valg. Testbare muskler til udstyret platform er begrænset til dem, der inducerer plantar udvidelse eller dorsiflexion af foden. For det tredje bør det igen understreges, at elektrodeplacering kan være udfordrende og kræver tålmodighed og praksis at mestre teknikken. Elektroder også blevet kedeligt hurtigt med regelmæssig brug, så det er nyttigt at have flere reservedele sETS til, når det bliver svært at punktere huden overfladisk. For det tredje, der er beskrevet i denne rapport protokol anvender specifikke stimulation sekvenser og procedurer dataanalyse. Musklen løftestang styresystem software og data analyse software og data, det giver kan besvare mange andre eksperimentelle spørgsmål og dermed dens anvendelighed strækker sig ud over, hvad der er skitseret heri. Som sådan er brugere opfordres til at udforske ud over grænserne for software-protokol (er) præsenteres i dette dokument. Trods disse mindre begrænsninger, in vivo muskelfunktion test er en kraftfuld metode til at bestemme sundhed og kontraktile evne skeletmuskel, fordi det er minimalt invasiv og kan udføres ved flere lejligheder, over en længere tidsramme på det samme dyr. Kort sagt, denne type af driftsklar nytte gør systemet særligt dygtige til at teste effekten af nye terapier for skeletmuskulatur skade eller sygdom hos rotter bagben.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Dr. Hannah Baker for her extensive work in optimizing this procedure.
Isothesia | Henry Schein Animal Health | 05260-04-04 | |
Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill | Vet Equip | 911103 | |
Inlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911124 | |
Outlet Adaptor for Vaporizer | Vet Equip | 911125 | |
Tabletop Anaesthesia Machine | Vet Equip | 901801 | |
Compressed oxygen gas | Praxair | N/A | |
VaporGuard Activated Charcoal Filter | Vet Equip | 931401 | |
T/Pump Professional water heater | Stryker | N/A | set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature |
Transpore Surgical Tape | 3M | 1527S-1 | rip in half to make thinner strips |
A5 Golden animal clippers | Oster | 078005-050-002 | |
Povidone-Iodine Solution | Aplicare | 82-227K | |
Alcohol Swabs | |||
200 proof Ethanol | Decon labs | diluted to 70% with deionized water | |
cotton tipped applicators | Puritan | 836-WC | |
Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode | Chalgren Enterprises | 111-725-24TP | |
servomotor | Cambridge Technology | Model 6650LR | |
Dual Mode Lever System | Aurora Scientific Inc | Model 305C-LR-FP | contact manufacturer to order |
Signal Interface | Aurora Scientific Inc | Model 604A | |
High-Power, Bi-Phase Stimulator | Aurora Scientific Inc | Model 701C | |
Data analysis software | Aurora Scientific Inc | DMAv5.110 software | |
Muscle lever system control software | Aurora Scientific Inc | DMCv5.400 software |