Questo protocollo descrive l'isolamento e la quantificazione di piccoli RNA di lipoproteine ad alta densità.
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Articolo metodologico
Isolamento di lipoproteine ad alta densità per non codificante Piccolo RNA Quantificazione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La diversità dei piccoli RNA non codificanti (sRNA) è in rapida espansione e il loro ruolo nei processi biologici, tra cui regolazione genica, stanno emergendo. Più interessante, sRNAs si trovano anche al di fuori delle cellule e sono stabilmente presenti in tutti i liquidi biologici. Come tale, sRNAs extracellulari rappresentano una nuova classe di biomarcatori di malattia e sono probabilmente coinvolti nella segnalazione cellulare e reti di comunicazione intercellulare. Per valutare il loro potenziale come biomarcatori, sRNAs possono essere quantificati nel plasma, urine e altri fluidi. Tuttavia, per comprendere appieno l'impatto di sRNAs extracellulari come segnali endocrini, è importante determinare quali vettori trasportano e li protegge nei fluidi biologici (ad esempio, plasma) che cellule e tessuti contribuiscono alle piscine Srna extracellulari, e le cellule e tessuti capaci di accettare e utilizzare extracellulare sRNA. Per raggiungere questi obiettivi, è fondamentale per isolare le popolazioni altamente pure di vettori extracellulariper sRNA profilatura e la quantificazione. Abbiamo precedentemente dimostrato che le lipoproteine, in particolare lipoproteine ad alta densità (HDL), i trasporti microRNA (miRNA) funzionali tra le cellule e HDL-miRNA sono significativamente alterati nella malattia. Qui, abbiamo dettaglio un nuovo protocollo che utilizza tandem isolamento HDL con ultracentrifugazione in gradiente di densità (DGUC) e fast-proteina-cromatografia liquida (FPLC) per ottenere HDL altamente puro per la profilatura a valle e la quantificazione di tutti sRNAs, tra miRNA, utilizzando sia alta sequenziamento -throughput e real-time PCR approcci. Questo protocollo sarà una risorsa preziosa per l'indagine di sRNAs su HDL.
Introduzione
Extracellulari non codificante piccoli RNA (sRNAs) rappresentano una nuova classe di biomarcatori di malattia e potenziali bersagli terapeutici e probabilmente facilitare la comunicazione 1 cella-a-cella. Il tipo più ampiamente studiato di sRNA sono microRNA (miRNA), che sono circa il 22 nti di lunghezza e vengono elaborati da forme precursori più lunghi e trascrizioni primari 2. miRNA hanno dimostrato di livello post-trascrizionale regolare l'espressione genica attraverso la soppressione della traduzione di proteine e induzione di mRNA degrado 2. Tuttavia, miRNA sono solo uno dei molti tipi di sRNAs; come sRNAs possono essere sci....
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Protocollo
1. HDL Purificazione (~ 5,5 giorni)
- In gradiente di densità Ultracentrifugazione (DGUC, ~ 5 giorni)
- Aggiungere 90 ml di 100x antiossidanti a 9 ml di plasma isolati dal sangue venoso fresco.
- Regolare la densità del plasma con KBr da 1.006 g / mL a 1.025 g / mL con l'aggiunta di 0,251 g di KBr a 9 ml di plasma dal punto 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr plasma). Rock the plasma finché tutto il sale viene disciolto a temperatura ambiente e trasferimento ultracentrifuge tubi e garantire tutte le bolle salire verso l'alto.
- Piegare la punta di un ago 18-G a 90 ° 1 cm dalla punta, lato smusso rivolto verso l'alto. Usando una siring....
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Risultati
Questo protocollo è una serie di metodi consolidati legati insieme per consentire la quantificazione della sRNAs sulla altamente puro HDL by high throughput sequencing o real-time PCR (Figura 1). Per dimostrare la fattibilità e l'impatto di questo protocollo, HDL è stato purificato da plasma umano con il metodo DGUC e FPLC tandem. Raccolti frazioni FPLC corrispondenti a HDL (il colesterolo dalla distribuzione) sono stati concentrati e RNA totale è stato isolato da 1 .......
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Discussione
Questo protocollo è stato progettato per quantificare miRNA ed altri sRNAs da high-throughput sequencing o real-time PCR altamente puro HDL. Come con qualsiasi approccio, considerazioni speciali dovrebbero essere dati ad ogni fase del processo di purificazione HDL e RNA e quindi quantificare sRNAs. Questo protocollo è stato progettato per i progetti che iniziano con ≥ 2 ml di plasma. Tuttavia, le analisi di RNA di alta qualità possono essere completati con successo con HDL purificato da un minimo di 80 ml di plasma uman.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da premi dal National Institutes of Health, National Heart, Lung and Blood Institute a K.C.V. HL128996, HL113039 e HL116263. Questo lavoro è stato anche sostenuto da premi dell'American Heart Association a K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 e R.M.A. POST25710170.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ultracentrifuga | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuga Rotore | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Sistema FPLC puro | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Colonne di aumento in linea | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| da tavolo centrifuga | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Centrifuga refrigerata | Eppendorf | 22629867 | 5417R (acquistabile tramite USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalizzatore | Agilent | G2938B | |
| Saggio del DNA ad alta sensibilità | Agilent | 5067-4626 | |
| Libreria di sequenziamento Kit di quantificazione qPCR | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Provette da centrifuga ultra trasparenti | Beckman Coulter | 344059 | |
| Bromuro di potassio | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| Provetta conica da 15 mL | Thermo Scientific | 339650 | |
| Filtri microcentrifughi 0,45 &; m | Millipore | UFC30HV00 | |
| Filtri microcentrifughi 0,22 &; micro; m | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Kit di isolamento dell'RNA totale | Qiagen | 217004 | |
| Kit colorimetrico per colesterolo totale | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| Filtro di centrifugazione cut-off da 10.000 m.w. | Amicon | UFC801024 | acquistato tramite provette per strisce PCR Millipore |
| Axygen | PCR-0208-C | acquistato tramite Fisher | |
| Kit microRNA RT | Life Technologies | 4366597 | Per 1000 reazioni |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | flacone da 50 ml |
| Kit Pierce BCA | Thermo Scientific | 23225 | |
| Kit per pulizia e concentratore | Zymo | D4014 | |
| Tubo per dialisi | Spectrum Labs | 132118 | acquistato tramite Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
Riferimenti
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
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Ristampe e permessi
