Udvikling af en mere følsom og specifik Chromogenic Agar Medium til detektion af<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Og Andet<em> Vibrio</em> Arter
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
Fødevarebårne infektioner i USA forårsaget af Vibrio arter har vist en opadgående tendens. I slægten Vibrio, V. parahaemolyticus er ansvarlig for hovedparten af Vibrio-associeret infektioner. Således nøjagtig differentiering blandt Vibrio spp. og påvisning af V. parahaemolyticus er kritisk vigtigt at sikre sikkerheden for vores fødevareforsyning. Selv molekylære teknikker bliver mere og mere almindelige, er kultur-afhængig metoder stadig rutinemæssigt gjort, og de betragtes standardmetoder under visse omstændigheder. Derfor blev en hidtil ukendt kromogent agarmedium testet med det mål at tilvejebringe en bedre fremgangsmåde til isolering og differentiering af klinisk relevant Vibrio spp. Protokollen sammenlignede følsomhed, specificitet og detektionsgrænse til påvisning af V. parahaemolyticus mellem den nye kromogene medium og et konventionelt medium. Forskellige V. parahaemolyticus stammer (n = 22) repræsentere forskellige serotyper og kilde til oprindelser blev brugt. De blev tidligere identificeret ved Food and Drug Administration (FDA) og Centers for Disease Control og Forebyggelse (CDC), og yderligere verificeres i vores laboratorium ved TLH -PCR. I mindst fire separate forsøg blev disse stammer inokuleret på de chromogene agar og thiosulfat-citrat-galdesalte-saccharose (TCBS) agar, hvilket er den anbefalede medium til dyrkning af denne art, efterfulgt af inkubation ved 35-37 ° C i 24 -96 time. Tre V. parahaemolyticus stammer (13,6%) er ikke vokset optimalt på TCBS, alligevel udstillet grønne kolonier, hvis der var vækst. To stammer (9,1%) gav ikke de forventede cyan kolonier på det kromogene agar. Ikke V. parahaemolyticus stammer (n = 32) blev også testet for at bestemme specificiteten af det kromogene agar. Blandt disse stammer, havde 31 ikke vokse eller udviste andre koloni morfologier. Den gennemsnitlige inddrivelse af V. parahaemolyticus på chromogenic agar var ~ 96,4% relativt til tryptisk soja-agar suppleret med 2% NaCl. Som konklusion nye kromogent agar er et effektivt medium til påvisning V. parahaemolyticus og at skelne det fra andre vibrioner.
Introduction
Som medlem af Vibrio slægten, V. parahaemolyticus er en gram-negativ, ikke-sporedannende, buede, stavformet bakterie. Det udviser høj motilitet i både flydende og halvfaste miljøer. De fleste V. parahaemolyticus stammer er ikke-patogene for mennesker, men de patogene subtyper har forårsaget epidemier og pandemier, hvorfor denne art anses for at være en vigtig fødevarebårne patogen i mange lande 1,2. Forekomsten af Vibrio-infektion i USA har vist en opadgående tendens siden 2000 3. Blandt Vibrio spp., V. parahaemolyticus er de hyppigst rapporterede arter forårsager sygdomme i USA 4,5. Andre klinisk relevante arter omfatter V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, etc. En lille procentdel af de sygdomme forårsages af flere arter samtidigt.
V. parahaemolyticus er en naturlig, jegnhabitant af havvand og derfor vidt udbredt i marine områder i hele verden, herunder flodmundinger. Arten blev opdaget i 1950 efter et udbrud af fødevareforgiftning i Japan. I USA blev de arter først isoleret i havvand, sedimenter og skaldyr i Puget Sound regionen 6,7. Filter foderautomater i marine habitater, såsom toskallede bløddyr, kan harbor V. parahaemolyticus som en del af deres naturlige flora 8. Som sådan V. parahaemolyticus infektioner i menneskelige er ofte knyttet til forbruget af forurenet fisk og skaldyr, især råt eller utilstrækkeligt skaldyr. En mindre almindelig rute for indrejse opstår, når åbne sår er udsat for havvand, hvilket fører til hudinfektion. De fleste V. parahaemolyticus stammer ikke forårsager sygdom hos mennesker, men visse undertyper huser virulensfaktorer såsom varmestabil direkte hæmolysin (TDH) er sygdomsfremkaldende. De mest udbredte symptomer på fødevarebåren V. parahaemolyticus infektion erdiarré og mavesmerter, efterfulgt af kvalme, opkastning og feber. Hovedpine og kulderystelser er også rapporteret. Medianen Inkubationstiden er 15 timer, men kan være op til 96 timer efter indtagelse af en tilstrækkelig mængde af patogene stammer 9. Sygdommen varer fra to til tre dage. De gastroenteritis symptomer forårsaget af V. parahaemolyticus er stort set selvbegrænsende og derfor særlig behandling er ikke nødvendig. Milde tilfælde af gastroenteritis kan behandles effektivt ved oral rehydrering. Mere alvorlige sygdomme kan behandles med antibiotika, såsom tetracyclin eller ciprofloxacin 10. Dødeligheden er omkring 2% for gastroenteritis tilfælde, men kan være så høj som 29% for dem, der udvikler blodbanen infektion eller sepsis. Enhver person, der indtager skaldyr eller har åbne sår udsat for havvand er i fare for V. parahaemolyticus infektion. Jo mere alvorlig form for sygdomme, livstruende blodforgiftning, er mere almindelig i en subpopulation med underliggende medicinsk cold 11, som omfatter alkoholisme, leversygdom, diabetes, nyresygdom, malignitet og andre betingelser, der fører til en svækket immunrespons. Især denne gruppe af individer er også på et højere risiko for ordregivende alvorlige sygdomme forårsaget af V. vulnificus, som kan findes i naturlige habitater ligner V. parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus rutinemæssigt isoleres ved anvendelse thiosulfat-citrat-galdesalte-saccharose (TCBS) agar som en selektiv og differentieret medium. Berigelse med alkalisk peptonvand kan gå forud for isolation på TCBS agar. Formodede kolonier på TCBS derefter yderligere testes i en matrix af biokemiske tests og / eller molekylære assays målrettet nærvær af artsspecifikke gener. PCR-baserede metoder bruges ofte til at bekræfte identiteten på V. parahaemolyticus ved at forstærke den termolabile hæmolysin genet, tlh 12.
Uanset hvilken lmOICE af bekræftelse metoder, er det vigtigt at have et effektivt medie til at isolere og differentiere V. parahaemolyticus fra andre marine vibrioner i første omgang. TCBS har rutinemæssigt været anvendt til at differentiere arter inden for Vibrio slægten efter evne til at fermentere sakkarose 12. Positiv fermenteringsreaktion er ledsaget af en farveændring af pH indikatoren bromthymolblåt. V. parahaemolyticus kolonier er temmelig karakteristisk på TCBS, udstiller blå til grøn farve. Dog kan dette medie ikke let skelne V. alginolyticus og V. cholerae. Saccharose-fermenterende Proteus arter kan producere gule kolonier ligner V. cholerae eller V. alginolyticus 13. Ved første isolation på TCBS, V. parahaemolyticus kan også fejlidentificerede som Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides, og Pseudomonas-arter 14. Stammer med saccharose ferm forsinketentation kan forveksles med andre saccharose nonfermenting Vibrio 13, som omfatter V. parahaemolyticus. TCBS viste sig at være ikke følsomme over for blandt andre Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens,. Flere andre arter giver grøn til grå kolonier, som potentielt forveksles med V. parahaemolyticus eller V. vulnificus 15. Som følge heraf er det ønskeligt at udvikle alternative dyrkningsmedier med bedre følsomhed og specificitet mod påvisning og isolering V. parahaemolyticus og andre nært beslægtede arter.
Flere medier alternativer er for nylig blevet udviklet. Udover medtagelse af selektive midler, mest indarbejde kromogene substrater at differentiere arter baseret på deres differentielle enzymatiske aktiviteter. For eksempel har indoxyl-β-glucosid og indoxyl-β-galactosid blevet anvendt som de chromogene substrater at differentiere V. parahaemolyticus kolonier (som synes blålig-grøn) fra dem af V. cholerae (lilla) på grund af deres differentielle evner til at producere β-glucosidase og β-galactosidase 16. Forskellige formuleringer af kromogent agar udviklet af flere grupper er blevet evalueret og rapporteret til at udføre sammenligneligt med eller bedre end TCBS 17,18,19. En fordel ved anvendelse af et kromogent medium er, at farvning af det omgivende medium er minimal hvilket letter isoleringen af bestemte kolonier. I denne undersøgelse vurderede vi evnen hos en nyformulerede kromogent medium til påvisning og isolering af V. cholerae, V. parahaemolyticus, og V. vulnificus; med særlig fokus på dens evne til at differentiere V. parahaemolyticus fra andre arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse fokuserer på dyrkningsmedier udvikling og evaluering. Konventionelt, TCBS er det selektive og differentierede medie, der anvendes til at isolere og afsløre V. parahaemolyticus, V. cholerae og V. vulnificus 12. Imidlertid er der rapporteret begrænsninger for dette medium, såsom den manglende evne til at differentiere V. cholerae fra andre Vibrio arter. Saccharose og pH-indikator er differentiering agenter for TCBS. Således syreproduktion ved saccharo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker M. Channey, E. Chau, og K. Tomas for deres bistand på projektet. Projekt forsyninger blev delvist finansieret af California Polytechnic State University.
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | Ambiente | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
Riferimenti
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- . Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008)
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States – major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. . Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- MacFaddin, J. F. . Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -. C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
