의 검출을위한 더 민감하고 특정 원체 한천 배지의 개발<em> 장염 비브리오 균</em> 및 기타<em> 비브리오</em> 종
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
비브리오 종에 의한 미국의 식품 매개 감염은 상승 추세를 보여 주었다. 속에서 비브리오, V. 비브리오 균은 비브리오 -associated 감염의 대부분을 담당합니다. 따라서, 비브리오 종 중 정확한 차별화. 및 V.의 검출 비브리오는 우리의 식량의 안전성을 보장하기 위해 매우 중요하다. 분자 기술이 점점 더 일반적입니다 만, 문화 따라 방법은 여전히 정기적으로 완료하고 특정 상황에서 표준 방법으로 간주됩니다. 따라서, 새로운 발색 한천 배지는 고립과 임상 적 비브리오 종의 분화를위한 더 나은 방법을 제공하는 것을 목표로 테스트했습니다. 프로토콜은 V.의 검출에 대한 민감도, 특이도 및 검출 한계 비교 새로운 발색 매체와 종래의 매체와 비브리오. 다양한 V. 비브리오 균주 (N = 22) 재다양한 혈청 형과 기원의 소스를 제시하는 사용되었다. 그들은 이전에 식품의 약국 (FDA)와 질병 통제 예방 센터 (CDC)에 의해 식별 및 추가 TLH – PCR에 의해 우리의 실험실에서 확인되었다. 적어도 네 개의 별개의 실험에서, 이들 균주를 24 35-37 ℃에서 인큐베이션 발색 한천 티오 – 구연산 담즙 염 – 자당이 종 배양 권장 매체 (TCBS) 한천에 접종 -96의 시간. 세 V. 성장이 있다면 비브리오 균주 (13.6 %)은 그럼에도 불구하고, TCBS에 최적 성장 녹색 식민지를 전시하지 않았다. 두 균주 (9.1 %)을 발색 한천 예상 시안 콜로니를 산출하지 않았다. 비 V. 비브리오 균주 (N = 32) 또한 발색 한천의 특이성을 결정하기 위해 시험 하였다. 이 균주 중 31 성장 또는 다른 식민지 형태학을 전시하지 않았다. V.의 평균 회복 chromoge에 비브리오 균NIC 한천은 1 ~ 2 % NaCl로 보충 트립신 콩 한천에 96.4 %의 상대였다. 결론적으로, 새로운 발색 한천 V.를 검출하는 효과적인 매체 비브리오 균과는 다른 vibrios 구별합니다.
Introduction
비브리오 속, V.의 구성원 비브리오는 그람 – 음성, 비 – 포자 형성, 곡면, 봉상 세균이다. 그것은 액체와 반고체 환경 모두에서 높은 운동성을 나타낸다. 대부분의 V. 비브리오 균주는 인간에게 비 병원성, 아직 병원성 하위 유형은 많은 나라 1, 2에 따라서이 종은 중요한 식품 매개 병원체로 간주됩니다 전염병과 전염병을 야기했다. 미국에서 비브리오 감염의 발생 빈도는 2000 3 년 이후 상승 추세를 보이고있다. 비브리오 종 중., V. 비브리오 균은 미국 4,5에서 질병을 일으키는 가장 빈번하게보고 된 종입니다. 기타 임상 관련 종 V. 포함 alginolyticus, V. 불 니피 쿠스 균, V. 콜레라 등 질병의 작은 비율은 동시에 여러 종에 의해 발생합니다.
V. 비브리오 균은 자연 전입니다해양 물 nhabitant 때문에 널리 하구를 포함하여 전 세계적으로 해양 물에 분산. 종은 일본에서 식중독의 발생 다음 1950 년에 발견되었다. 미국의 경우, 종 먼저 퓨젯 사운드 지역 6,7 해수, 퇴적물, 어패류에서 격리되었다. 같은 조개 조개 등 해양 서식지에서 필터 피더는, V. 항구 수 있습니다 자연 식물 8의 일환으로 비브리오. 같은 V.로 인간의 비브리오 균 감염은 주로 오염 된 해산물, 특히 원시 또는 덜 익힌 조개의 소비에 연결되어 있습니다. 열린 상처 피부 감염으로 이어지는, 해수에 노출되었을 때 항목의 덜 일반적인 경로가 발생합니다. 대부분의 V. 비브리오 균주는 인간의 질병을 유발하지 않는, 아직 같은 내열성 직접 용혈 (TDH)와 같은 독성 요소를 품고 특정 서브 타입은 병원성입니다. 인성 V.의 가장 일반적인 증상 비브리오 균 감염은메스꺼움, 구토, 발열 다음에 설사와 복통,. 두통과 오한도보고됩니다. 평균 잠복기는 15 시간이지만, 병원성 균주 (9) 충분한 양의 소비 후 96 시간에 할 수 있습니다. 질병은 2 ~ 3 일에서 지속됩니다. V.로 인한 위장관 증상 비브리오 균은 주로 자기 제한하고, 따라서 특별한 치료는 필요하지 않습니다. 위장염의 가벼운 경우 효과적으로 구강 수분 보충에 의해 처리 될 수있다. 더 심각한 질병은 테트라 사이클린이나 시프로플록사신 (10)과 같은 항생제로 치료 될 수있다. 사망률 위장염 케이스에 대해 2 %이지만, 혈류 감염 패혈증을 개발하는 사람들에게 29 %만큼 높을 수있다. 해수에 노출 열린 상처 해산물을 소비하거나이있는 사람은 V. 위험에 비브리오 균 감염. 질병, 생명을 위협하는 패혈증의 더 심각한 형태는, 기본 의료 협력과 하위 집단에서 더 일반적이다알콜 중독, 간 질환, 당뇨병, 신장 질환, 악성 종양, 및 약화 된 면역 반응으로 이어지는 다른 조건을 포함하는 nditions 11. 특히, 개인의이 그룹은 V.에 의한 심각한 질병을 계약에 대한 위험이 높은도 V. 유사한 자연 서식지에서 찾을 수 있습니다 불 니피 쿠스 균, 비브리오.
V. 비브리오 균은 일상적으로 선택 및 차등 매체로 티오 – 구연산 – 담즙 염 – 자당 (TCBS) 한천을 사용하여 격리됩니다. 알칼리 펩톤 물에 농축는 TCBS 한천에 격리 앞에있다. TCBS에 추정 콜로니는 상기 종 특이 유전자의 존재를 타겟팅 생화학 검사 및 / 또는 분자의 배열 분석법에서 테스트한다. PCR 기반의 방법들은 종종 V.의 신원을 확인하는 데 사용 12 TLH는 thermolabile 용혈 유전자 증폭 비브리오.
에 관계없이 채널의확인 방법 OICE, V.를 분리 및 구별 할 수있는 효과적인 매체 것이 중요 처음에 다른 해양 vibrios에서 비브리오. TCBS 일상적 수크로오스 12 발효 능력에 따른 비브리오 속에서 종을 구별하기 위해 사용되었다. 포지티브 발효 반응은 pH를 지표 브로 모티 몰 블루의 색 변화를 동반한다. V. 비브리오 균 식민지 녹색 색상에 파란색을 전시, TCBS에 상당히 독특한입니다. 그러나이 매체는 쉽게 구별 V. 없다 alginolyticus 및 V. 콜레라. 자당-발효 테우스 종 V.를 닮은 노란색 식민지를 생성 할 수있다 콜레라 나 V. alginolyticus 13. TCBS, V.에 초기 격리에 비브리오 균은 모나스의 hydrophila, Plesiomonas의 shigelloides 및 슈도모나스 종 (14)로 잘못 식별 할 수있다. 지연 자당 FERM와 균주[슬라이드 쇼]는 V.를 포함 비브리오 (13) nonfermenting 다른 크로스와 혼동 될 수있다 비브리오. TCBS는 다른 사람의 사이에서 대장균, 슈도모나스 putrefaciens 상대로하지 민감한 것으로 밝혀졌다. 다른 몇몇 종은 잠재적 V.과 혼동되어 회색 식민지 녹색 산출 비브리오 균이나 V. 불 니피 쿠스 균 15. 그 결과, 검출 V. 분리 향해 나은 민감도와 특이 대체 배지를 개발하는 것이 바람직하다 비브리오 균 및 기타 밀접하게 관련 종.
여러 대안 매체가 최근 개발되었다. 선택적 제제를 포함하는 것 외에도, 대부분이 차동 효소 활성에 기초하여 종을 구별 할 발색 기질을 통합한다. 예를 들어, indoxyl-β 글루코 시드와 indoxyl-β-갈 락토는 V. 차별화 발색 기질로 사용되어왔다 파라V.과는 (푸른 빛이 도는 녹색으로 표시) 해 몰리 식민지 그들의 차동 능력에 (보라색) 콜레라는 β – 글루코시다 제 및 β – 갈 락토시다 제 (16)를 생성한다. 여러 그룹에서 개발 한 발색 한천의 다른 제형은 평가되었으며에 상대적으로 또는 TCBS 17,18,19보다 더 나은 수행하는 것으로보고되었다. 발색 매체를 사용하는 장점은 주변 매질의 착색함으로써 특정 콜로니 분리를 용이 최소화한다는 것이다. 본 연구에서, 우리는 V.를 검출하고 분리하는 신규 제형 발색 매체의 능력을 평가 콜레라, V. 비브리오 균 및 V. 불 니피 쿠스 균; V. 차별화 할 수있는 능력에 특별한 초점을 다른 종에서 비브리오.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구는 배양 배지 개발 및 평가에 초점을 맞추고 있습니다. 종래 TCBS 인 선택적 및 매체 V. 분리 및 검출을 위해 사용되는 차동 비브리오 균, V. 콜레라 및 V. 불 니피 쿠스 균 (12). 그러나, 이러한 제한은 V. 구별 할 수 없다는,이 매체에 대해보고 된 다른 비브리오 종에서 콜레라. 자당 및 pH를 표시 TCBS의 분화 에이전트입니다. 따라서, 자당 발효기에…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 프로젝트에 대한 그들의 지원 M. Channey, E. 차우 및 K. 토마스 감사합니다. 프로젝트 공급이 부분적으로 캘리포니아 폴리 테크닉 주립 대학에 의해 투자되었다.
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | Ambiente | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
Riferimenti
- Yeung, P. S., Boor, K. J. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).
- Yeung, P. S. M., Boor, K. J., Faruque, S. M. Epidemiology, molecular biology, and detection of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne and Waterborne Bacterial pathogens: Epidemiology, Evolution and Molecular Biology. , 153-184 (2012).
- Centers for Disease Control and Prevention. Vital Signs: Incidence and Trends of Infection with Pathogens Transmitted Commonly Through Food – Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 1996-2010. Morbidity and Mortality Weekly Report. 10, 1996-2010 (2011).
- . Summary of human Vibrio cases reported to CDC, 2008 Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/21591 (2008)
- Scallan, E., et al. Foodborne illness acquired in the United States – major pathogens. Emerg. Infect. Dis. 17 (1), 7-15 (2011).
- Baross, J., Liston, J. Occurrence of Vibrio parahaemolyticus and related hemolytic vibrios in marine environments of Washington State. Appl. Microbiol. 20 (2), 179-186 (1970).
- Baross, J., Liston, J. Isolation of Vibrio parahaemolyticus from the Northwest Pacific. Nature. 217 (5135), 1263-1264 (1968).
- Kueh, C. S., Chan, K. Y. Bacteria in bivalve shellfish with special reference to the oyster. J. Appl. Bacteriol. 59 (1), 41-47 (1985).
- Food and Drug Administration. . Bad Bug Book, Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins. , (2012).
- Qadri, F., et al. Adaptive and inflammatory immune responses in patients infected with strains of Vibrio parahaemolyticus. J. Infect. Dis. 187 (7), 1085-1096 (2003).
- MacFaddin, J. F. . Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. 1, (1985).
- Bottone, E. J., Robin, T. Vibrio parahaemolyticus: suspicion of presence based on aberrant biochemical and morphological features. J. Clin. Microbiol. 8 (6), 760-763 (1978).
- Lotz, M. J., Tamplin, M. L., Rodrick, G. E. Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar and its selectivity for clinical and marine vibrio organisms. Ann. Clin. Lab. Sci. 13 (1), 45-48 (1983).
- Hara-Kudo, Y., Nishina, T., Nakagawa, H., Konuma, H., Hasegawa, J., Kumagai, S. Improved method for detection of Vibrio parahaemolyticus in seafood. Appl. Environ. Microbiol. 67 (12), 5819-5823 (2001).
- Eddabra, R., Piemont, Y., Scheftel, J. M. Evaluation of a new chromogenic medium, chromID Vibrio, for the isolation and presumptive identification of Vibrio choleare and Vibrio parahaemolyticus from human clinical specimens. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 30 (6), 733-737 (2011).
- Kodaka, H., Teramura, H., Mizuochi, S., Saito, M., Matsuoka, H. Evaluation of the Compact Dry VP method for screening raw seafood for total Vibrio parahaemolyticus. J. Food. Prot. 72 (1), 169-173 (2009).
- Su, Y. C., Duan, J., Wu, W. H. Selectivity and specificity of a chromogenic medium for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Prot. 68 (7), 1454-1456 (2005).
- Bej, A. K., Patterson, D. P., Brasher, C. W., Vickery, M. C., Jones, D. D., Kaysner, C. A. Detection of total and hemolysin-producing Vibrio parahaemolyticus in shellfish using multiplex PCR amplification of tl, tdh and trh. J. Microbiol. Methods. 36 (3), 215-225 (1999).
- Yeung, P. S. M., DePaola, A., Kaysner, C. A., Boor, K. J. A PCR assay for specific detection of the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone from shellfish. J. Food Sci. 68 (4), 1459-1466 (2003).
- Yeung, P. S. M., Hayes, M. C., DePaola, A., Kaysner, C. A., Kornstein, L., Boor, K. J. Comparative phenotypic, molecular, and virulence characterization of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 isolates. Appl. Environ. Microbiol. 68 (6), 2901-2909 (2002).
- Duan, J., Su, Y. -. C. Comparison of a chromogenic medium with thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar for detecting Vibrio parahaemolyticus. J. Food Sci. 70, M125-M128 (2005).
- Pinto, A. D., Terio, V., Novello, L., Tantillo, G. Comparison between thiosulphate-citrate-bile salt sucrose (TCBS) agar and CHROMagar Vibrio for isolating Vibrio parahaemolyticus. Food Control. 22 (1), 124-127 (2011).
- Canizalez-Roman, A., Flores-Villaseñor, H., Zazueta-Beltran, J., Muro-Amador, S., Leòn-Sicairos, N. Comparative evaluation of a chromogenic agar medium-PCR protocol with a conventional method for isolation of Vibrio parahaemolyticus strains from environmental and clinical samples. Can J Microbiol. 57 (2), 136-142 (2011).
- Kriem, M. R., et al. Prevalence of Vibrio spp. in raw shrimps (Parapenaeus longirostris) and performance of a chromogenic medium for the isolation of Vibrio strains. Lett Appl Microbiol. 61 (3), 224-230 (2015).
- Food Drug Administration. Statistical guidance on reporting results from studies evaluating diagnostic tests. http://www.fda.gov/RegulatoryInformation/Guidances/ucm071148.htm. , (2007).
- Burd, E. M. Validation of laboratory-developed molecular assays for infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 23 (3), 550-576 (2010).
