Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von<em> Vibrio parahaemolyticus</em> Und andere<em> Vibrio</em> Arten
Summary
Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.
Abstract
Lebensmittelbedingte Infektionen in der durch Vibrio – Spezies verursacht USA haben einen Aufwärtstrend gezeigt. In der Gattung Vibrio, V. parahaemolyticus verantwortlich für die meisten Vibrio -assoziierten Infektionen. So präzise Differenzierung zwischen Vibrio spp. und Detektion von V. parahaemolyticus ist von entscheidender Bedeutung für die Sicherheit unserer Nahrungsmittelversorgung zu gewährleisten. Obwohl molekulare Techniken immer häufiger sind, kultur je Methoden sind immer noch routinemäßig durchgeführt, und sie sind unter bestimmten Umständen von Standardmethoden in Betracht gezogen. Daher wurde eine neue chromogene Agarmedium mit dem Ziel untersucht , eine bessere Methode zur Isolierung und der Differenzierung von klinisch relevanten Vibrio spp bereitzustellen. Das Protokoll verglichen , um die Sensitivität, Spezifität und Nachweisgrenze für die Detektion von V. parahaemolyticus zwischen dem neuen chromogenes Medium und einem herkömmlichen Medium. Verschiedene V. parahaemolyticus – Stämme (n = 22) rediverse Serotypen und die Quelle der Herkunft präsentiert wurden verwendet. Sie waren zuvor von der Food and Drug Administration (FDA) und Centers for Disease Control and Prevention (CDC) identifiziert und weiter in unserem Labor von TLH -PCR verifiziert. In mindestens vier getrennten Versuchen wurden diese Stämme auf dem chromogenen Agar und Thiosulfat-Citrat-Gallensalze-Saccharose (TCBS) Agar beimpft, die die empfohlene Medium zum Kultivieren dieser Spezies ist, gefolgt von einer Inkubation bei 35-37 ° C für 24 -96 h. Drei V. parahaemolyticus – Stämme (13,6%) wuchs nicht optimal auf TCBS, dennoch zeigte grüne Kolonien , wenn es Wachstum war. Zwei Stämme (9,1%) brachte nicht die erwarteten Cyan Kolonien auf dem chromogenen Agar. Nicht V. parahaemolyticus – Stämme (n = 32) wurden auch die Spezifität des chromogenen Agar zu bestimmen getestet. Unter diesen Stämmen wuchsen, 31 nicht oder anderen Morphologien Kolonie ausgestellt. Die mittlere Rückgewinnung von V. parahaemolyticus auf der chromogenic Agar war ~ 96,4%, bezogen auf CASO-Agar mit 2% NaCl ergänzt. Im Ergebnis ist die neue chromogene Agar ein effektives Medium V. nachzuweisen parahaemolyticus und es von anderen Vibrionen zu unterscheiden.
Introduction
Als Mitglied der Gattung Vibrio, V. parahaemolyticus ist ein Gram-negative, nicht-sporenbildende, gekrümmte, stabförmiges Bakterium. Es weist eine hohe Beweglichkeit in sowohl flüssigen als auch halbfesten Umgebungen. Die meisten V. parahaemolyticus Stämme sind nicht pathogen für den Menschen, aber die pathogenen Subtypen Epidemien und Pandemien verursacht, daher ist diese Spezies als 1,2 ein wichtiges Lebensmittel übertragene Erreger in vielen Ländern zu sein. Die Inzidenz von Vibrio – Infektion in den USA hat sich seit dem Jahr 2000 3 einen Aufwärtstrend gezeigt. Unter Vibrio spp., V. parahaemolyticus ist die am häufigsten Spezies berichtet Krankheiten in den USA 4,5 verursacht. Andere klinisch relevante Arten gehören V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae usw. Ein kleiner Prozentsatz der Erkrankungen wird gleichzeitig von mehreren Arten verursacht.
V. parahaemolyticus ist eine natürliche inhabitant von Meerwasser und damit in Meeresgewässern in der ganzen Welt, einschließlich der Mündungen weit verbreitet. Die Art wurde im Jahr 1950 nach einem Ausbruch der Lebensmittelvergiftung in Japan entdeckt. In den USA wurde die Art erstmals in Meerwasser, Sedimenten und Muscheln in der Region 6,7 Puget Sound isoliert. Filtrierer und in der marinen Lebensräume, wie Muscheln Muscheln, kann V. Hafen parahaemolyticus als Teil ihrer natürlichen Flora 8. Als solche V. parahaemolyticus Infektionen bei Mensch sind oft auf den Verzehr von kontaminierten Meeresfrüchten zurückzuführen sind, insbesondere rohen oder ungekochten Schalentiere. Eine weniger häufige Route der Eintrag erfolgt, wenn offene Wunde dem Meerwasser ausgesetzt ist, was zu einer Infektion der Haut. Die meisten V. parahaemolyticus – Stämme verursachen keine Krankheit beim Menschen, noch bestimmte Subtypen Virulenzfaktoren wie thermo direkte Hämolysin (TDH) sind beherbergen pathogen. Die häufigsten Symptome von Lebensmittelvergiftungen V. parahaemolyticus – InfektionDurchfall und Bauchschmerzen, gefolgt von Übelkeit, Erbrechen und Fieber. Kopfschmerzen und Schüttelfrost sind auch berichtet. Die mediane Inkubationszeit beträgt 15 Stunden, kann jedoch bis zu 96 Stunden nach dem Verzehr einer ausreichenden Menge an pathogenen Stämmen 9 sein. Die Krankheit dauert von zwei bis drei Tagen. Die Gastroenteritis Symptome verursacht durch V. parahaemolyticus sind weitgehend selbstlimitierend und deshalb Spezialbehandlung ist nicht erforderlich. Leichte Fälle von Gastroenteritis wirksam durch orale Rehydratation behandelt werden. Weitere schwere Erkrankungen können 10 von Antibiotika wie Tetracyclin oder Ciprofloxacin behandelt werden. Die Sterblichkeit liegt bei etwa 2% für Gastroenteritis Fällen, kann aber als 29% für die so hoch sein, die Blut-Infektion oder Sepsis zu entwickeln. Jede Person , die Meeresfrüchte verzehrt oder hat offene Wunde dem Meerwasser ausgesetzt ist gefährdet von V. parahaemolyticus Infektion. Die schwere Form von Krankheiten, lebensbedrohlichen Sepsis, ist häufiger in einer Subpopulation mit zugrunde liegenden medizinischen coBedingungen ausgebracht 11, der Alkoholismus, Lebererkrankungen, Diabetes, Nierenkrankheit, Bösartigkeit und andere Bedingungen zu einer geschwächten Immunantwort führt. Bemerkenswert ist , ist diese Gruppe von Individuen , auch zu einem höheren Risiko für schwere Vertrags von V. verursachte Krankheiten vulnificus, die in natürlichen Lebensräume ähnlich wie V. gefunden werden kann parahaemolyticus.
V. parahaemolyticus wird routinemäßig unter Verwendung von Thiosulfat-Citrat-Gallensalze-Saccharose (TCBS) Agar als selektiver und Differenzierungsmedium isoliert. Die Anreicherung in alkalischem Peptonwasser kann Isolation auf TCBS Agar vorangehen. Präsumptive Kolonien auf TCBS werden dann weiter in einer Reihe von biochemischen Tests getestet und / oder molekulare Assays, die die Anwesenheit von Spezies-spezifischen Gene Targeting. PCR-basierten Verfahren werden häufig verwendet , um die Identität von V. bestätigen parahaemolyticus durch das thermolabile Hämolysin – Gen verstärkt, tlh 12.
Unabhängig von der chStimm – Bestätigungsverfahren ist es wichtig , ein wirksames Medium zu haben , V. , zu isolieren und zu differenzieren parahaemolyticus von anderen Meeres Vibrionen in den ersten Platz. TCBS hat routinemäßig innerhalb der Vibrio Gattung Spezies zu unterscheiden , entsprechend ihren Fähigkeiten Saccharose 12 zu gären eingesetzt. Positive Fermentationsreaktion wird durch eine Farbänderung des pH – Indikators Bromthymolblau begleitet. V. parahaemolyticus Kolonien sind ziemlich unverwechselbar auf TCBS, Ausstellen blau zu grün. Jedoch kann dieses Medium nicht leicht unterscheiden V. alginolyticus und V. cholerae. Sucrose-Fermentation von Proteusarten gelbe Kolonien ähnlich V. produzieren kann cholerae oder V. alginolyticus 13. Bei der ersten Isolation auf TCBS, V. parahaemolyticus kann auch als Aeromonas hydrophila, Plesiomonas shigelloides falsch identifiziert werden, und Pseudomonas spp 14. Stämme mit verzögerter Saccharose fermsentation kann mit anderen Saccharose nonfermenting Vibrio 13, verwechselt werden , die V. umfassen parahaemolyticus. TCBS wurde als nicht empfindlich gegen Escherichia coli, Pseudomonas putrefaciens unter anderem gefunden. Mehrere andere Arten ergeben grün zu grau Kolonien , die mit V. möglicherweise verwechselt werden parahaemolyticus oder V. vulnificus 15. Als Ergebnis ist es wünschenswert , alternative Kulturmedien zu Erfassung mit einer besseren Empfindlichkeit und Spezifität und V. Isolierung zu entwickeln , parahaemolyticus und andere eng verwandte Arten.
Mehrere Medien Alternativen vor kurzem entwickelt wurden. Neben der Aufnahme von selektiven Agenzien, inkorporieren meisten chromogene Substrate Spezies zu unterscheiden, basierend auf ihrer unterschiedlichen enzymatischen Aktivitäten. Beispielsweise Indoxyl-β-glucosid und indoxyl-β-galactosid wurden als chromogene Substrate verwendet , zu unterscheiden V. parahaemolyticus Kolonien (die blaugrün erscheinen) von denen V. cholerae (lila) aufgrund ihrer unterschiedlichen Fähigkeiten β-Glucosidase und 16 β-Galactosidase zu produzieren. Verschiedene Formulierungen von chromogenen Agar von mehreren Gruppen entwickelt wurden bewertet und wurden zur Durchführung vergleichsweise gemeldet oder besser als TCBS 17,18,19. Ein Vorteil eines chromogenen Mediums besteht darin, dass die Färbung des umgebenden Mediums minimal ist, wodurch die Isolierung von bestimmten Kolonien zu erleichtern. In dieser Studie haben wir die Fähigkeit eines neu chromogenes Medium formuliert zu detektieren und zu isolieren , V. cholerae, V. parahaemolyticus und V. vulnificus; mit einem besonderen Fokus auf seine Fähigkeit , V. zu unterscheiden parahaemolyticus von anderen Spezies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie konzentriert sich auf Kulturmedien Entwicklung und Evaluierung. Herkömmlicherweise TCBS ist die selektive und Medium zur Isolierung und Detektion V. Differential verwendet parahaemolyticus, V. cholerae und V. vulnificus 12. Es wurden jedoch Einschränkungen berichtet V. für dieses Medium, wie die Unfähigkeit , zu differenzieren cholerae aus anderen Vibrio – Spezies. Sucrose und pH-Indikator sind die Differenzierungsmittel von TCBS. Somit ve…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken M. Channey, E. Chau, und K. Tomas für ihre Unterstützung für das Projekt. Projekt Lieferungen wurden zum Teil von der California Polytechnic State University finanziert.
Materials
| Reagent/Equipment | |||
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-15-4 | may use other brands |
| Autoclave | Any | ||
| BHI powder | Fisher Scientific | DF0418-17-7 | may use other brands |
| Blender | Any | to blend oyster meat | |
| CampyGen gas generator | Hardy Diagnostics | CN035A | to provide a microaerophilic atmosphere; may use other brands |
| Chocolate agar plates | Hardy Diagnostics | E14 | may use other brands |
| Common PCR reagents (dNTPs, MgCl2, Taq Polymerase) | Any | or use PCR beads (Fisher Sci 46-001-014) | |
| Culture tubes | Fisher Scientific | S50712 | may use other brands |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | S348903 | may use other brands |
| Gel doc | Any | ||
| HardyChrom Vibrio agar plates | Hardy Diagnostics | G319 | This study evaluates this medium |
| Incubator | Any | ||
| Inoculating loops | Fisher Scientific | 22-363-606 | 10 microliter-size was used in this study |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | may use other brands |
| Oysters | Any | ||
| PBS | Fisher Scientific | R23701 | may use other brands |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | may use other brands |
| Pipette and tips | Any | Sterilized tips | |
| Primers for tlh | IDT DNA | ||
| Scale | Any | ||
| Spreader | Fisher Scientific | 08-100-11 | Beads may be used instead |
| Stomacher blender | Stomacher | 400 | Samples were homogenized at 200 rpm for 30 sec. Other homogenizer can be used. |
| Sterile filter bags for blenders | Fisher Scientific | 01-812-5 | |
| TCBS powder | Hardy Diagnostics | 265020 | This study evaluates this medium |
| Thermocycler | Any | ||
| TSB powder | Fisher Scientific | DF0370-07-5 | may use other brands |
| UV viewing cabinet | Any | Emit long-wave UV light | |
| Water bath | Any | ||
| Name | Sources | Catalog Number | Comments |
| Bacterial species and strains | |||
| Aeromonas hydrophila | ATCC | ||
| Candida albicans | ATCC | ||
| Campylobacter jejuni | ATCC | ||
| Escherichia coli | ATCC | ||
| Proteus mirabilis | ATCC | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ||
| Staphylococcus aureus | ATCC | ||
| Salmonella Choleraesuis | ATCC | ||
| Shigella boydii | ATCC | ||
| Shigella flexneri | ATCC | ||
| Shigella sonnei | ATCC | ||
| Vibrio alginolyticus | ATCC | ||
| V. cholerae (serotypes include O139, O1, non O1, El Tor biovars) | FDA, ATCC | ||
| V. damsela | FDA | ||
| V. fisherii | Ambiente | ||
| V. fluvialis | CDC | ||
| V. furnissii | CDC | ||
| V. hollisae | FDA | ||
| V. metschnikovii | ATCC | ||
| V. mimicus | FDA | ||
| V. parahaemolyticus(serotypes include O3:K6, O1:K56, O4:K8, O5:K15, O8, etc) | ATCC, FDA, CDC, Environment | ||
| V. proteolyticus | FDA | ||
| V. vulnificus | FDA |
Riferimenti
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