تحريض الحاد الهيكل العظمي تجديد العضلات التي Cardiotoxin حقن
Summary
توضح هذه المخطوطة بروتوكول مفصلة للحث الحاد تجديد الهيكل العظمي والعضلات في الفئران البالغة والتلاعب اللاحقة للعضلات، مثل التشريح، وتجميد، قطع، وتلطيخ الروتيني، وليف عضلي تحليل منطقة مستعرضة.
Abstract
الهيكل العظمي تجديد العضلات هي عملية الفسيولوجية التي تحدث في العضلات والهيكل العظمي الكبار في الاستجابة لإصابة أو مرض. حاد الإصابة الناجمة عن تجديد العضلات والهيكل العظمي هو يستخدم على نطاق واسع وقوي نظام نموذجي لدراسة الأحداث تشارك في تجديد العضلات وكذلك الآليات ومختلف اللاعبين. في الواقع، معرفة مفصلة من هذه العملية ضرورية لفهم أفضل للظروف المرضية التي تؤدي إلى ضمور العضلات والهيكل العظمي، وأنها تساعد في تحديد استراتيجيات علاجية جديدة هادفة. يصف هذا العمل بروتوكول مفصلة وقابلة للتكرار للحث الحاد تجديد الهيكل العظمي والعضلات في الفئران عن طريق الحقن العضلي واحد من cardiotoxin (CTX). CTX ينتمي إلى عائلة من السموم سم الأفعى ويسبب تحلل العضل من myofibers، الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى أحداث تجديد. يتم تقييم ديناميات تجديد الهيكل العظمي والعضلات عن طريق التحليل النسيجي للأقسام العضلات. البروتوكول أيضايوضح الإجراءات التجريبية للتشريح، وتجميد، وقطع العضلات قصبة الساق الأمامية، فضلا عن الروتيني الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ التي يتم استخدامها على نطاق واسع للتحليل الصرفي والمورفولوجية لاحق.
Introduction
تتشكل الكبار الثدييات العضلات والهيكل العظمي من قبل مجموعات من fascicules من خلايا العضلات متعددة النوى (myofibers) التي تخصصت للانكماش. كل ليف عضلي هو مخلى ممدود، وتحيط بها غمد الليف العضلي (غشاء PLASMATIC) والتي تحتوي على اللييفات العضلية، والتي تتكون من البروتينات مقلص نظمت بشكل منتظم ومتكرر (الأكتين والميوسين خيوط). في حياة الكبار وفي ظروف الراحة والعضلات والهيكل العظمي لها دوران منخفض جدا من myonuclei من 1؛ في الواقع، وmyonuclei، والتي تقع في محيط ليف عضلي، تحت غمد الليف العضلي، وألقي القبض عليه في مرحلة G0 من دورة الخلية وغير قادر على التكاثر 1،2.
عضلات الهيكل العظمي لديها القدرة على التجدد غريبة التالية الضرر، ليصل إلى التوازن بعد عدة أحداث إعادة تشكيل الأنسجة التي ترتبط ارتباطا وثيقا بعضها البعض. بعد الإصابة الحادة أو الصدمة، وبفعل انحطاط، تليها عمليات تجديدالتي تشارك فيها أعداد مختلفة من الخلايا، بما في ذلك عدد السكان المقيمين في خلايا العضلات والخلايا الأقمار الصناعية (المنبوذة). في الواقع، في غياب أي محفزات البيئية، والخلايا الأقمار الصناعية في حالة هادئة وتقع في محراب المتخصصة بين غمد الليف العضلي و3،4 الصفيحة القاعدية. بعد الإصابة أو المرض، المنبوذة تصبح تفعيلها، وتتكاثر، الهجرة إلى المناطق المتضررة، وأخيرا تمييز، مما أدى إلى تشكيل حديثا myofibers 5. المنبوذة تنشيط تؤسس عبر الحديث مع السكان خلية مختلفة، وذلك أساسا الخلايا الالتهابية، والتي يتم تعيينهم في الموقع من الصدمة 6-8. هذا عبر الحديث يسمح للخلايا لمتابعة نموذج التنظيم التي الإشارات الجزيئية بالسيارة التعديلات الهيكلية، مما يؤدي في النهاية إلى توازن 9. إلى جانب المنبوذة، الخلايا الالتهابية والخلالي، عمليات عائية، وأحداث إعادة تعصيب-ويشارك فيه ايضا، يتصرف بطريقة منسقة لإصلاح هذه درجة عالية من التنظيم والصورةهيكل pecialized.
هناك اهتمام كبير في دراسة الجوانب المختلفة لتجديد الهيكل العظمي والعضلات، وليس فقط لفهم علم وظائف الأعضاء من العضلات، ولكن أيضا لتحسين الاستراتيجيات العلاجية التي تتطلب معرفة أعمق للعملية برمتها. عدة طرق التجريبية متوفرة لدراسة الهوية وظيفة من مختلف السكان الخلية، ومسارات الإشارات، والآليات الجزيئية التي تشارك حاليا. نماذج الماوس من الإصابة الحادة تمثل أداة قوية لتحقيق العديد من جوانب هذه العملية. مختلفة تستخدم عادة تقنيات للحث على تلف العضلات الحاد تسمح للباحثين لمتابعة عملية تجديد في الجسم الحي، من المراحل المبكرة جدا من نهاية العملية. يصف هذا البروتوكول على بعد خطوات من طريق الحقن العضلي من cardiotoxin المستمدة سم ثعبان (CTX)، والتي يدفع تحلل العضل ويطلق عملية تجديد، وصولا إلى تحليل عينات الأنسجة. بعد الحقن CTX، ميلم يمكن التضحية في نقاط زمنية مختلفة اعتمادا على متطلبات التجريبية، والعضلات والهيكل العظمي يمكن تشريح ومعالجتها لمزيد من التحليل. وأخيرا، نحن تصف البروتوكول تلطيخ أقسام الأنسجة لأداء الملاحظات الشكلية والتحليلات الكمية الأساسية. يسمح هذا البروتوكول لدراسة الحاد تجديد الهيكل العظمي والعضلات في الجسم الحي بطريقة استنساخه للغاية (10).
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف بروتوكول للحث على إصابة حادة في العضلات والهيكل العظمي (أي الحقن العضلي من CTX). يستخدم على نطاق واسع على أنها أداة قوية لدراسة ديناميات تجديد الهيكل العظمي والعضلات في الجسم الحي. حقن CTX الحث على تحلل الألياف العضلية، والذي كان سببه الاستقطاب من ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
Riferimenti
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
- Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
- Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
- Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7 (2014).
