Inductie van Acute Skeletal Muscle Regeneration door cardiotoxine Injection
Summary
Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor acute skeletspier regeneratie bij volwassen muizen en latere manipulaties van de spieren, zoals dissectie, bevriezen, snijden, routine kleuring en myofiber dwarsdoorsnede analyse induceren.
Abstract
Skeletspier aanpassing een fysiologisch proces dat plaatsvindt bij volwassen skeletspieren als reactie op letsel of ziekte. Acute verwonding geïnduceerde skeletspier aanpassing een veel gebruikt, krachtig modelsysteem om de gebeurtenissen betrokken bij spierregeneratie alsook de mechanismen en verschillende spelers bestuderen. Inderdaad, een gedetailleerde kennis van deze werkwijze is essentieel voor een beter begrip van de pathologische omstandigheden die leiden tot skeletspier degeneratie, en het helpt bij het identificeren van nieuwe gerichte therapeutische strategieën. De huidige werk beschrijft een gedetailleerd en reproduceerbare protocol voor acute skeletspier regeneratie in muizen te induceren via een enkele intramusculaire injectie van cardiotoxine (CTX). CTX behoort tot de familie van slangengif toxines en veroorzaakt myolyse van myovezels, die uiteindelijk leidt tot de regeneraties. De dynamiek van de skeletspieren regeneratie wordt geëvalueerd door histologische analyse van de spier secties. Het protocol ooktoont de experimentele procedures voor het ontleden, het invriezen en het snijden van de tibialis anterior spier, en de routine hematoxyline en eosine kleuring die op grote schaal wordt gebruikt voor latere morfologische en morfometrische analyse.
Introduction
Zoogdieren volwassen skeletspieren worden gevormd door groepen van fascicules van meerkernige spiercellen (spiervezels), die gespecialiseerd zijn voor samentrekking zijn. Elke spiervezeloriėntaties een langwerpig syncytia, omringd door de sarcolemma (plasmamembraan) en die myofibrils, die bestaan uit regelmatig en herhaaldelijk georganiseerde contractiele eiwitten (actine en myosine filamenten). Bij volwassen leven en in rusttoestand, skeletspieren hebben een zeer lage omzet van hun myonuclei 1; inderdaad, de myonuclei, die zich aan de rand van de spiervezeloriėntaties onder sarcolemma worden aangehouden in de G0-fase van de celcyclus en niet in staat te prolifereren 1,2.
Skeletspieren hebben de bijzondere mogelijkheid om te regenereren na schade, het bereiken van homeostase na een aantal gebeurtenissen van weefselremodellering die nauw verwant zijn aan elkaar. Na een acuut letsel of trauma, degeneratie wordt veroorzaakt, gevolgd door regeneratie processendat verschillende celpopulaties, met inbegrip van een bevolking van spiercellen te betrekken, de satelliet cellen (SCS). Inderdaad, bij gebrek aan omgevingsstimuli, de satelliet cellen in een rusttoestand en bevinden zich in een niche tussen de sarcolemma en de basale lamina 3,4. Na een verwonding of ziekte, SC's geactiveerd worden, prolifereren, te migreren naar het beschadigde gebied, en uiteindelijk differentiëren, die aanleiding geven tot nieuw gevormde myovezels 5. Geactiveerde SC stellen cross-talk met verschillende celpopulaties, voornamelijk ontstekingscellen, die worden aangeworven in de plaats van trauma 6-8. Deze overspraak laat de cellen een gereglementeerd paradigma waarmee moleculaire signalen rijden structurele veranderingen volgen, uiteindelijk leidend tot 9 homeostase. Bovendien SC, inflammatoire en interstitiële cellen, angiogene processen en reïnnervatie gebeurtenissen betrokken stelt een gecoördineerde wijze repareren goed georganiseerde en specialized structuur.
Er is grote belangstelling voor het bestuderen van verschillende aspecten van skeletspieren regeneratie niet alleen de fysiologie van de spier te begrijpen, maar ook voor therapeutische strategieën die diepere kennis over het gehele proces te verbeteren. Verschillende experimentele benaderingen zijn beschikbaar om de identiteit en functie van de verschillende celpopulaties, de signaalwegen en de moleculaire mechanismen te bestuderen. Muismodellen van acuut letsel vormen een krachtig hulpmiddel om vele aspecten van dit proces te onderzoeken. Andere gewoonlijk gebruikte technieken voor het induceren van acute spierschade kunnen onderzoekers het regeneratieproces volgen in vivo, van het prille begin tot het einde van het proces. Dit protocol beschrijft de stappen van de intramusculaire injectie van slangengif-afgeleide cardiotoxine (CTX), die myolyse induceert en activeert het regeneratieproces tot de analyse van weefselmonsters. Na CTX injectie, mice kunnen op verschillende tijdstippen opgeofferd afhankelijk experimentele eisen en de skeletspieren kan worden uitgesneden en verwerkt voor verdere analyse. Tenslotte beschrijven we de kleuring protocol van het weefsel secties om morfologische observaties en fundamentele kwantitatieve analyses uit te voeren. Dit protocol maakt het onderzoek naar acute skeletspier regeneratie in vivo op zeer reproduceerbare wijze 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een protocol om acuut letsel in de skeletspier (dat wil zeggen, de intramusculaire injectie van CTX) induceren. Het wordt veel gebruikt als een krachtig instrument om de dynamiek van de skeletspier regeneratie in vivo te bestuderen. CTX injectie induceert de degeneratie van spiervezels, die wordt veroorzaakt door de depolarisatie van de sarcolemma en contractie van de vezels 12, en leidt tot de cascade van gebeurtenissen die leidt tot spierregeneratie. Skeletspieren ontle…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
Riferimenti
- Morgan, J. E., Partridge, T. A. Muscle satellite cells. Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).
- Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy. J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).
- Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).
- Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function. Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).
- Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).
- Saclier, M., et al. Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration. Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).
- Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications. Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).
- Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).
- Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis. Mediators Inflamm. 2015, (2015).
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).
- Arnold, L., et al. Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis. J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).
- Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom. Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Mann, C. J., et al. Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle. Skelet Muscle. 1 (1), (2011).
- Pessina, P., et al. Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy. Skelet Muscle. 4 (1), 7 (2014).
