Induction de aiguë Skeletal Muscle Régénération par cardiotoxine Injection
Summary
Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour induire régénération du muscle squelettique aiguë chez la souris adulte et manipulations ultérieures des muscles, comme la dissection, le gel, la coupe, coloration de routine, et myofibre analyse de surface en coupe transversale.
Abstract
Régénération du muscle squelettique est un processus physiologique qui se produit dans les muscles squelettiques adultes en réponse à une lésion ou une maladie. Aiguë régénération du muscle squelettique induite par blessure est un système puissant modèle largement utilisé pour étudier les événements impliqués dans la régénération musculaire, ainsi que les mécanismes et les différents acteurs. En effet, une connaissance détaillée de ce processus est essentiel pour une meilleure compréhension des conditions pathologiques qui conduisent à la dégénérescence des muscles squelettiques, et il aide à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblées. Le présent ouvrage décrit un protocole détaillé et reproductible pour induire régénération du muscle squelettique aiguë chez la souris par une injection intramusculaire unique de cardiotoxine (CTX). CTX appartient à la famille des serpents toxines de venin et provoque myolyse de myofibres, ce qui déclenche finalement les événements de régénération. La dynamique de la régénération du muscle squelettique est évaluée par une analyse histologique de coupes de muscle. Le protocole a égalementillustre les procédures expérimentales pour la dissection, le gel, et en coupant le muscle jambier antérieur, ainsi que l'hématoxyline & éosine routine qui est largement utilisé pour l'analyse morphologique et morphométrique ultérieure.
Introduction
les muscles squelettiques chez les mammifères adultes sont formés par des groupes de fascicules de cellules musculaires multinucléées (les myofibres) qui sont spécialisées pour la contraction. Chaque myofibres est un syncytium allongé, entouré par le sarcolemme (membrane plasmatique) et contenant des myofibrilles qui sont constitués de protéines contractiles régulièrement et de manière répétée organisées (actine et la myosine). Dans la vie adulte et dans des conditions de repos, les muscles squelettiques ont un chiffre d' affaires très faible de leur myonuclei 1; en effet, les noyaux musculaires, qui sont situés à la périphérie de la myofibres, sous le sarcolemme, sont arrêtés dans la phase G0 du cycle cellulaire et sont incapables de proliférer 1,2.
les muscles squelettiques ont la capacité propre à se régénérer après une lésion, atteignant homéostasie après plusieurs événements de remodelage tissulaire qui sont étroitement liés les uns aux autres. Après une blessure aiguë ou d'un traumatisme, la dégénérescence est induite, suivie par les processus de régénérationqui comportent des populations de cellules différentes, y compris une population résidente de cellules musculaires, les cellules satellites (CS). En effet, en l'absence de tout stimulus environnemental, les cellules satellites sont dans un état quiescent et sont situés dans un créneau spécialisé entre le sarcolemme et la lame basale de 3,4. Suite à une blessure ou d'une maladie, SCs sont activées, proliférer, migrer vers les zones endommagées, et finalement la différence, ce qui donne lieu à des myofibres nouvellement formant 5. SCs Activé établir cross-talk avec différentes populations cellulaires, principalement des cellules inflammatoires, qui sont recrutés dans le site du traumatisme 6-8. Ce cross-talk permet aux cellules de suivre un paradigme réglementé par lequel des signaux moléculaires conduisent des modifications structurelles, pour aboutir finalement à l' homéostasie 9. Outre SCs, les cellules inflammatoires et interstitielles, processus angiogéniques, et les événements ré-innervation sont également impliqués, agissant de manière coordonnée pour réparer ce très organisé et sStructure nstru.
Il y a un grand intérêt dans l'étude de différents aspects de la régénération du muscle squelettique, non seulement de comprendre la physiologie du muscle, mais aussi d'améliorer les stratégies thérapeutiques qui nécessitent une connaissance plus approfondie de l'ensemble du processus. Plusieurs approches expérimentales sont actuellement disponibles pour étudier l'identité et la fonction des différentes populations cellulaires, les voies de signalisation et les mécanismes moléculaires impliqués. Des modèles murins de blessures aiguës représentent un outil puissant pour étudier de nombreux aspects de ce processus. Différentes techniques couramment utilisées pour induire des lésions musculaires aiguës permettent aux chercheurs de suivre le processus de régénération in vivo, à partir des premières étapes à la fin du processus. Ce protocole décrit les différentes étapes de l'injection intramusculaire de cardiotoxine de venin de serpent dérivée (CTX), ce qui induit myolyse et déclenche le processus de régénération, jusqu'à l'analyse des échantillons de tissus. Après injection CTX, miCE peut être sacrifiée à différents points dans le temps en fonction des besoins expérimentaux, et les muscles squelettiques peut être disséqué et traitées pour une analyse ultérieure. Enfin, nous décrivons le protocole de coloration des coupes de tissus pour effectuer des observations morphologiques et des analyses quantitatives de base. Ce protocole permet l'étude de la régénération du muscle squelettique aiguë in vivo d'une manière hautement reproductible 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous décrivons un protocole pour induire une lésion aiguë dans le muscle squelettique (ie, l'injection intramusculaire de CTX). Il est largement utilisé comme un outil puissant pour étudier la dynamique de régénération du muscle squelettique in vivo. L' injection CTX induit la dégénérescence des fibres musculaires, ce qui est provoqué par la dépolarisation du sarcolemme et la contraction des fibres 12 et déclenche la cascade d'événements qui conduit à la ré…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
Riferimenti
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