Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection
Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per indurre rigenerazione muscolare acuta nei topi adulti e successive manipolazioni dei muscoli, come dissezione, gelati, taglio, colorazione di routine, e myofiber analisi sezione trasversale.
Abstract
rigenerazione muscolare scheletrico è un processo fisiologico che si verifica nei muscoli scheletrici adulti in risposta a infortunio o malattia. rigenerazione del muscolo scheletrico lesione indotta acuta è un potente sistema modello ampiamente utilizzato per studiare gli eventi coinvolti nella rigenerazione muscolare così come i meccanismi e giocatori diversi. Infatti, una conoscenza dettagliata di questo processo è essenziale per una migliore comprensione delle condizioni patologiche che portano alla degenerazione muscolare scheletrico, e aiuta a identificare nuove strategie terapeutiche mirate. Il presente lavoro descrive un protocollo dettagliato e riproducibile per indurre la rigenerazione del muscolo scheletrico acuta nei topi attraverso una singola iniezione intramuscolare di cardiotossina (CTX). CTX appartiene alla famiglia di serpente tossine veleno e causa miolisi di miofibre, che alla fine scatena gli eventi di rigenerazione. La dinamica della rigenerazione muscolare viene valutata mediante analisi istologica delle sezioni muscolari. Il protocollo ancheillustra le procedure sperimentali per dissezione, gelati, e tagliando il muscolo tibiale anteriore, così come la routine colorazione ematossilina e eosina che è ampiamente usato per la successiva analisi morfologica e morfometrica.
Introduction
muscoli scheletrici dei mammiferi adulti sono formate da gruppi di fascicoli di cellule muscolari multinucleate (miofibre) che sono specializzati per la contrazione. Ogni myofiber è un sincizio allungato, circondato dal sarcolemma (membrana plasmatica) e miofibrille contenenti, che sono costituiti da proteine contrattili regolarmente e ripetutamente organizzati (actina e miosina filamenti). Nella vita adulta e, in condizioni di riposo, i muscoli scheletrici hanno un fatturato molto basso di loro mionuclei 1; infatti, le myonuclei, che si trovano alla periferia della myofiber, sotto il sarcolemma, vengono arrestati nella fase G0 del ciclo cellulare e sono in grado di proliferare 1,2.
I muscoli scheletrici hanno la peculiare capacità di rigenerare seguenti danni, raggiungendo l'omeostasi dopo diversi eventi di rimodellamento tissutale che sono strettamente legati gli uni agli altri. Dopo una lesione acuta o un trauma, degenerazione è indotta, seguito da processi di rigenerazioneche coinvolgerà diverse popolazioni di cellule, tra cui una popolazione residente di cellule muscolari, le cellule satellite (SCS). Infatti, in assenza di stimoli ambientali, le cellule satelliti sono in uno stato quiescente e si trovano in una nicchia specializzata tra il sarcolemma e 3,4 lamina basale. A seguito di un infortunio o di malattia, SC si attivano, proliferare, migrare verso le aree danneggiate, e alla fine di differenziare, dando luogo a nuova formazione myofibers 5. SC attivate stabilire cross-talk con diverse popolazioni di cellule, cellule infiammatorie soprattutto, che vengono reclutati nel sito del trauma 6-8. Questo cross-talk permette alle cellule di seguire un paradigma regolamentato attraverso il quale i segnali molecolari che guidano modifiche strutturali, portando infine all'omeostasi 9. Oltre SC, cellule infiammatorie e interstiziali, processi di angiogenesi, e gli eventi ri-innervazione sono anche coinvolti, che agisce in modo coordinato per riparare questo altamente organizzato e sStruttura pecialized.
C'è grande interesse a studiare diversi aspetti della rigenerazione muscolare, non solo di comprendere la fisiologia del muscolo, ma anche per migliorare le strategie terapeutiche che richiedono la conoscenza profonda di tutto il processo. Diversi approcci sperimentali sono attualmente disponibili per studiare l'identità e funzione delle diverse popolazioni cellulari, le vie di segnalazione e dei meccanismi molecolari coinvolti. modelli murini di danno acuto rappresentano un potente strumento per studiare molti aspetti di questo processo. Diverse tecniche comunemente usato per indurre un danno muscolare acuto consentire ai ricercatori di seguire il processo di rigenerazione in vivo, dalle primissime fasi alla fine del processo. Questo protocollo descrive i passi da iniezione intramuscolare di cardiotossina veleno di serpente-derivato (CTX), che induce miolisi e innesca il processo di rigenerazione, fino all'analisi di campioni di tessuto. Dopo l'iniezione CTX, mice può essere sacrificato a tempi diversi a seconda delle esigenze sperimentali, ei muscoli scheletrici può essere sezionato e trattati per ulteriori analisi. Infine, si descrive il protocollo di colorazione delle sezioni di tessuto per effettuare osservazioni morfologiche e analisi quantitative di base. Questo protocollo consente lo studio della rigenerazione muscolare acuta in vivo in modo altamente riproducibile 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un protocollo per indurre lesioni acute nel muscolo scheletrico (ovvero, l'iniezione intramuscolare di CTX). È ampiamente usato come un potente strumento per studiare la dinamica di rigenerazione muscolare in vivo. Iniezione CTX induce la degenerazione delle fibre muscolari, che è causato dalla depolarizzazione della sarcolemma e la contrazione delle fibre 12, e innesca la cascata di eventi che conduce alla rigenerazione muscolare. I muscoli scheletrici sono sezionati …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
Riferimenti
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