通过注射心脏毒素急性骨骼肌再生的诱导
Summary
该原稿描述了详细的协议来诱导成年小鼠和肌肉的随后的操作，如解剖，冷冻，切割，常规染色，和肌纤维横截面积分析急性骨骼肌再生。
Abstract
骨骼肌再生是发生在成人骨骼肌中响应损伤或疾病的生理过程。急性损伤诱导的骨骼肌再生是研究参与肌肉再生以及机制和不同玩家的事件一种广泛使用的，强大的模型系统。实际上，这个过程的详细知识是为了更好地理解的病理状况导致骨骼肌变性必需的，而且它在确定新的靶向治疗策略有助于。目前的工作描述了一个详细的和可重复的协议，并通过单次肌注的心脏毒素（CTX）诱导小鼠急性骨骼肌再生。 CTX属于家庭的蛇毒毒素和导致肌纤维的myolysis，最终触发再生事件。骨骼肌再生的动力学是由肌肉切片的组织学分析评价。该协议还示出了用于解剖，冷冻，并切割该胫骨前肌，以及，被广泛用于后续形态学和形态分析例程苏木曙红染色的实验程序。
Introduction
哺乳动物成人骨骼肌是由多核肌细胞（肌纤维）是专门为收缩fascicules群体形成。每个肌纤维是细长的合胞体，由肌膜（质膜）和含有肌原纤维，这是由定期多次组织收缩蛋白（肌动蛋白和肌球蛋白丝）所包围。在成年生活中，在休息的条件下，骨骼肌有其肌细胞核1非常低的营业额;的确，肌细胞核，这是位于肌纤维的周围，肌膜下，在细胞周期的G0期被捕并且无法增殖1,2。
骨骼肌必须重新生成以下的损伤，组织重塑的几个事件紧密相关的互相后达到稳态的特有能力。急性损伤或外伤之后，变性诱导，随后通过再生过程涉及不同的细胞群，包括肌肉细胞的常住人口中，卫星细胞（SCS）。事实上，在没有任何环境刺激的，卫星细胞是处于静止状态，位于肌膜和基底层3,4之间的专门利基。以下内容的损伤或疾病，旺成为激活，增殖，迁移到受损区域，并最终分化，从而引发新形成肌纤维5。活化的SC建立与不同细胞群，主要炎症细胞，这是在创伤6-8的部位招募串扰。这种串扰允许细胞遵循稳压范例通过该分子信号驱动结构上的修改，最终导致动态平衡9。此外旺，炎症和间质细胞，血管生成过程，并重新支配的事件也都参与其中，以协调的方式采取行动，以修复此高度组织化和Specialized结构。
有在研究骨骼肌再生的各个方面，不仅要了解肌肉的生理机能，同时也提高需要全过程的深入了解治疗策略的极大兴趣。几个实验的方法是目前可用来研究不同细胞群体，信号通路，以及所涉及的分子机制的标识和功能。急性损伤的小鼠模型代表一个强有力的工具来研究这个过程的许多方面。不同常用的技术来诱导急性肌肉损伤允许研究遵循再生过程在体内 ，从非常早期阶段的过程中结束。这个协议描述从肌肉注射蛇毒来源的心脏毒素的（CTX），其诱导myolysis并触发再生过程中，最多的组织样本的分析的步骤。继CTX注射，MICE可以在不同的时间点，这取决于实验要求被牺牲，并且骨骼肌可以解剖并进行进一步的分析处理。最后，我们描述了组织切片的染色方案来执行形态学观察和基本定量分析。该协议允许对急性骨骼肌再生的体内以高度重现的方式10的研究。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里，我们描述了协议来诱导骨骼肌（ 即，CTX的肌内注射）急性损伤。它被广泛地用作一种强大的工具来研究骨骼肌再生的动态体内 。 CTX注射诱导的肌纤维，它是由肌膜的去极化和纤维12的收缩而引起的变性，并触发，导致肌肉再生事件的级联。骨骼肌是在注射和损伤后所要求的时点解剖，根据实验的要求，并用于后续的组织学分析。解剖的肌肉可以被冻结，夹杂在冷冻保…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Animal House and the Integrated Microscopy Facilities of IGB-CNR. This work has benefited from research funding from the European Community’s Seventh Framework Programme in the project ENDOSTEM (Activation of vasculature associated stem cells and muscle stem cells for the repair and maintenance of muscle tissue, grant agreement number 241440), the Italian Ministry of Education-University-Research (MIUR-PRIN2 010-2011) to G.M. and S.B. and PON Cluster IRMI to G.M., and the CARIPLO foundation to G.M. and S.B.
Materials
| Cardiotoxin from Naja mossambica mossambica | SIGMA ALDRICH | C9759 | |
| Syringe For Insulin BD Micro-Fine+ Needle 30 G X 8 mm – Da 0,3 ml | BD | 324826 | |
| Tragacanth Gum | MP BIOMEDICALS,LLC | 104792 | |
| 2-Methylbutane (Isopentane) | SIGMA ALDRICH | 78-78-4. | |
| OCT Killik Solution For Inclusion Cryostat | Bio-optica | 05-9801 | |
| Feather Microtome Blade S35 | Bio-optica | 01-S35 | |
| Glass Slide Superfrost Plus | Menzel-Gläser | 09-OPLUS | |
| Dumon #5 Mirror Finish Forceps | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 11251-23 | |
| Scissors Straight Sharp/Sharp | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15024-10 | |
| Scissors Noyes Straight | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 15012-12 | |
| Fine Iris Scissors Straight Sharp/Sharp 10,5 Cm | 2BIOLOGICAL INSTRUMENTS | 14094-11 | |
| Eukitt | Bio-optica | 09-00100 | |
| Slide Coverslip | BIOSIGMA | VBS651 | |
| Xylene | SIGMA ALDRICH | 214736 | |
| Ethanol 100% | sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Hematoxyline | J.T. BAKER | 3873 | |
| Eosin | SIGMA ALDRICH | HT110116 | |
| Cryostat | LEICA | CM3050 S |
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