Modèle in vivo pour tester l' effet de l' hypoxie sur la tumeur métastase
Summary
This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.
Abstract
Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm3. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.
Introduction
Le sarcome d'Ewing (ES) est une tumeur maligne agressive affectant les enfants et les adolescents. 1 Les tumeurs se développent dans les tissus mous et les os, généralement dans les membres. Alors que la présence de métastases est le plus puissant facteur pronostique défavorable pour les patients ES, les mécanismes sous-jacents à leur développement restent floues. 2 est une tumeur hypoxie des quelques facteurs impliqués dans la progression ES. ES chez les patients, la présence de zones non perfusé dans le tissu de la tumeur est associée à un mauvais pronostic. 3 In vitro, l' hypoxie augmente invasivité des cellules ES et déclenche l' expression de gènes pro-métastatiques. 4-6 Cependant, malgré ces éléments de preuve, aucune preuve directe pour ES induite par l' hypoxie progression et la propagation existe. En outre, les mécanismes par lesquels l'hypoxie exerce de tels effets sont, à l'heure actuelle, inconnus. Par conséquent, nous avons créé un modèle in vivo pour combler l'écart entre les existants des données in vitro et obser cliniquevations. Ce système modèle permet de tester directement les effets de l' hypoxie sur les tumeurs qui se produisent dans leur environnement naturel, en utilisant l' imagerie par résonance magnétique (IRM) pour suivre la progression tumorale et les métastases in vivo en combinaison avec ex vivo analyses pathologiques et moléculaires (figure 1).
Comme aucun modèle transgénique établi des ES est actuellement disponible, les études in vivo sur les propriétés métastatiques de ces tumeurs reposent sur des injections de cellules humaines dans des souris immunodéprimées. Bien que l'utilisation d'animaux déficients immunologiquement peut sous-estimer l'impact du système immunitaire sur la progression de la maladie, la capacité d'utiliser des cellules humaines augmente traductibilité de ces études. Parmi les modèles de xénogreffes différents, les injections systémiques dans la veine caudale sont les plus faciles à réaliser, mais ils omettent les étapes initiales de cellules tumorales intravasation et d'échapper à partir du site principal de la croissance. 12/07 D'autre part, orthoto pic xénogreffe, qui implique des injections de cellules tumorales dans les os (fémur, côtes) ou les muscles, est techniquement plus difficile, mais aussi biologiquement plus pertinentes pour le cancer humain. 13-16 Cependant, dans le passé, le taux élevé de morbidité associée à la croissance rapide des tumeurs primaires a souvent nécessité l' euthanasie des animaux avant le développement de métastases. Dans cette étude, nous avons utilisé un modèle préalablement établi des injections de cellules dans le muscle gastrocnémien, suivie par l'excision de la tumeur primaire résultante combinée avec un suivi longitudinal de la progression métastatique par IRM. 17,18 Ces injections dans le muscle gastrocnémien à proximité du tibia permettent la croissance tumorale dans deux ES naturelles environnements – les muscles et les os – et entraîner des métastases à distance à des endroits généralement affectés chez les humains. 18 Ainsi, ce modèle récapitule avec précision les processus métastatiques qui se produisent chez les patients ES lors de la progression de la maladie.
tente "> La localisation des tumeurs primaires dans le hindlimb inférieur facilite également le contrôle précis de l'approvisionnement en sang dans le tissu tumoral. artère fémorale ligature (FAL) est une technique bien établie utilisée dans la recherche de l'angiogenèse pour bloquer le flux sanguin vers les régions distales la jambe et étudier vascularisation des tissus en réponse à une ischémie. 19,20 importante, la chute initiale dans le flux sanguin est suivi par une sûreté ouverture du vaisseau et la reperfusion tissulaire observée à environ 3 jours après la FAL. 20 Ainsi, lorsqu'il est effectué dans un membre porteur d'une tumeur, ce modèle recrée les événements hypoxie / reperfusion qui se produisent naturellement dans les tumeurs à croissance rapide et permet l'échappement des cellules tumorales métastatiques dues à la restauration de la perfusion du hindlimb inférieure via les vaisseaux collatéraux nouvellement ouverts. 21 Fait important, cette procédure doit être effectuée lorsque la taille de la tumeur est suffisamment faible pour prévenir l'hypoxie excessive dans les tumeurs témoins (typiquement au porteur d'une tumeur veau volume de 150-250 mm 3), assurant des différences significatives dans les niveaux de l' hypoxie tumorale entre les groupes témoins et FAL-traités.Outre le suivi longitudinal de l'effet de l'hypoxie sur ES latence et la fréquence des métastases, ce modèle permet également la collecte des tissus et le développement de nouvelles lignées cellulaires à partir des tumeurs primaires et des métastases. Surtout, les travaux antérieurs établi que des lignées de cellules de métastases dérivées présentent un potentiel métastatique accrue sur la réintroduction d'animaux, ce qui indique que la diffusion de la tumeur est associée à des changements permanents dans le phénotype de cellules tumorales et validant ainsi l'utilisation de ces lignées de cellules pour déchiffrer les processus métastatiques. 18 Collectivement, ces modèles peuvent maintenant être utilisés pour les analyses génétiques et moléculaires nécessaires à l' identification des voies métastatiques induite par l' hypoxie.
Comme l'hypoxie est un facteur pro-métastatique améliorant la malignité de divers tumors, notre modèle peut être utilisé comme une plate-forme pour étudier le rôle de l'hypoxie dans d'autres types de tumeurs qui se développent naturellement dans les membres, comme l'ostéosarcome et le rhabdomyosarcome. 21-23 En outre, une approche similaire peut être appliquée à des tumeurs malignes en croissance dans d' autres localisations anatomiques avec une voie d'approvisionnement en sang bien défini. En fin de compte, le modèle peut être modifié et son utilité en outre étendu, en fonction des besoins individuels de recherche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre modèle implique la comparaison des métastases dans les deux groupes expérimentaux – un groupe de contrôle, où on laisse les tumeurs se développer dans la patte arrière suivie d' une amputation après avoir atteint un volume de veau de 250 mm 3, et un groupe hypoxie exposée, dans laquelle l' une tumeur hindlimb roulement est soumise à un FAL au même volume, suivie par une amputation 3 jours plus tard. Bien que, dans ces expériences, les tumeurs traitées par FAL sont amputés avec un l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health (NIH) grants: UL1TR000101 (previously UL1RR031975) through the Clinical and Translational Science Awards Program, 1RO1CA123211, 1R03CA178809, R01CA197964 and 1R21CA198698 to JK. MRI was performed in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Preclinical Imaging Research Laboratory (PIRL) and tissue processing in the Georgetown-Lombardi Comprehensive Cancer Center’s Histopathology & Tissue Shared Resource, both supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. The authors thank Dan Chalothorn and James E. Faber, Department of Cell Biology and Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill, for their assistance with postmortem x-ray angiography, and providing insight and expertise on collaterogenesis.
Materials
| SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells | ATCC | ||
| TC71 Human ES cells | Kindly provided from Dr. Toretsky | ||
| McCoy's 5A (modified) Medium | Gibco by Life Technologies | 12330-031 | |
| RPMI-1640 | ATCC | 30-2001 | |
| PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500mL | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco by Life Technologies | 15140-122 | |
| Fungizone® Antimycotic | Gibco by Life Technologies | 15290-018 | |
| MycoZap™ Prophylactic | Lonza | VZA-2032 | |
| Collagen Type I Rat tail high concetration | BD Biosciences | 354249 | |
| SCID/beige mice | Harlan or Charles River | 250 (Charles River) or 18602F (Harlan) | |
| 1 mL Insulin syringes with permanently attached 28G½ needle | BD | 329424 | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP) | Hospira, INC | NDC 0409-7984-37 | |
| Digital calipers | World Precision Instruments, Inc | 501601 | |
| Surgical Tools | Fine Science Tools | ||
| Rimadyl (Carprofen) Injectable | Zoetis | ||
| Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid) | HPI, Inc | HP-100mg | |
| hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250mg) | HPI, Inc | CCI-103F-250mg | |
| Povidone-iodine Swabstick | PDI | S41350 | |
| Sterile alcohol prep pad | Fisher HealthCare | 22-363-750 | |
| LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment) | Major Pharaceuticals | NDC 0904-5168-38 | |
| VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56617-014 | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade | Oster | 078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade) | |
| Nair Lotion with baby oil | Church & Dwight Co., Inc. | ||
| Silk 6-0 | Surgical Specialties Corp | 752B | |
| Prolene (polypropylene) suture 6-0 | Ethicon | 8680G | |
| Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0 | Ethicon | J386H | |
| Fisherbrand Applicators (Purified cotton) | Fisher Scientific | 23-400-115 | |
| GelFoam Absorbable Dental Sponges – Size 4 | Pfizer Pharmaceutical | 9039605 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | |
| Autoclip remover | BD | 427637 | |
| Aound clip | BD | 427631 | |
| MRI 7 Tesla | Bruker Corporation | ||
| Paravision 5.0 software | Bruker Corporation | ||
| CO2 Euthanasia system | VetEquip | ||
| 25G 5/8 Needle (for heart-puncture) | BD | 305122 | |
| 0.1 mL syringe (for heart-puncture) | Terumo | SS-01T | |
| K3 EDTA Micro tube 1.3ml | Sarstedt | 41.1395.105 | |
| 10% Neutral Buttered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 |
Riferimenti
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