Protokollen giver en metode til at opløse aerob kornet slam for at udvinde alginat-lignende ekstracellulære polymerer (ale).
To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.
I de senere år den aerobe granuleret slam (AGS) proces er blevet en populær biologisk spildevandsrensning proces, anvendt med succes på flere fuldskala renseanlæg 1. I modsætning til den konventionelle aktiveret slam proces, i AGS behandle mikroorganismerne danner granuler stedet for flokke 2. Disse granuler har bedre sedimentationsevnen, er i stand til at modstå højere organiske ifyldningsgrader, og har højere tolerance over for toksicitet end aktiverede slam flokke 3.
I modsætning til biofilm, er AGS dannet spontant uden involvering af nogen bæremateriale 4. I AGS, ligesom i biofilm, mikroorganismer producerer en betydelig mængde af stærkt hydratiserede ekstracellulære polymere stoffer (EPS) 5 til dannelse af en hydrogel matrix, hvori de er selv-immobiliseret 4 – 6. EPS er en kompleks blanding, der består af polysaccharider, proteiner, nukleinsyrer, (phospho) lipider, humusstoffer og nogle intercellulære polymerer 5,7,8. Disse polymere stoffer interagerer med hinanden via elektrostatiske kræfter, hydrogenbindinger, attraktive ioniske kræfter og / eller biokemiske reaktioner osv 5, der danner en tæt og kompakt tertiær netstruktur. Polymererne i EPS som er i stand til at danne hydrogeler 4,9 og bidrager til dannelsen af den tertiære netværksstruktur er i denne henseende betragtes som strukturelle EPS, en delmængde af de samlede EPS.
EPS er ansvarlige for den kemiske struktur og fysiske egenskaber af granuler 5. Det er derfor afgørende at forstå funktionen af hver EPS sammensatte. Anvendes forskellige tilgange til at udtrække EPS 10 – 15. Men på grund af deres meget store kompleksitet, er det næsten umuligt at udtrække alle de EPS komponenter med en enkelt metode. Til dato er der ingen "one size fits all" metode til EPS udvinding. Valget af ekstraktionsmetode påvirker ikke kun det samlede beløb, men også sammensætningen af de udvundne polymerer 13,16 – 20. Afhængigt af typen af slam og EPS interesse forskellige metoder er nødvendige.
Udtræk geldannende polymerer, der karakteriserer deres egenskaber og undersøger deres samspil med hinanden og med ikke-geldannende EPS vil bidrage til at afsløre den rolle EPS i aerob granuleret slam dannelse. Endvidere er de geldannende polymerer er også egnede biopolymerer i industrielle applikationer. En mulig anvendelse er allerede vist ved hjælp af gel-dannende polymerer fra AGS som belægningsmateriale for at forøge vandtætheden af papir 21.
Derfor er der behov ekstraktionsmetoder, specifikke for geldannende EPS. Formålet med denne undersøgelse er at udvikle en metode til at udtrække geldannende EPS fra AGS. Seks ekstraktionsmetoder 10-15,22, som anvendes hyppigt i litteraturen, blev udvalgt til at udtrække EPS fra AGS. Det samlede beløb og det geldannende egenskab af de ekstraherede EPS blev sammenlignet for hver metode.
Bemærkninger til protokollen sektion
Ekstraktionen af EPS / ALE beskrives ved et volumen på 50 ml og 3 g granulat. Disse værdier er beregnet som retningslinjer. Ekstraktioner med højere koncentrationer granula kan mindske udbyttet af de ekstraherede EPS. Under udvinding af ALE skal holdes konstant temperaturen ved 80 ° C i 30 minutter. Den nødvendige tid til blandingen at varme op (ca. 5 min) er inkluderet i protokollen. Endvidere er udvinding effekt forøges ved anvendelse af en magnetisk omrører af samme størrelse som diameteren af kolben bund. Dette vil resultere i gode blandeegenskaber og formaling effekter, fremme udvinding af EPS.
Senere i protokollen afsnit er TS og VS udbytter af alle ekstraktioner (supernatant indsamlet i trin 1.1-1.6) bestemmes. Dialyse skal udføres før TS og VS måling for at mindske eventuelle fejl på grund af tilstedeværelsen af kemikalier, der anvendes til ekstraktion. ENMWCO på 3.500 Da anbefales at fjerne disse kemikalier samtidig bevare EPS makromolekyler i dialyseposen. Dialyseposen bør have et større volumen end volumenet af ekstrakten. Dette er nødvendigt, da lydstyrken af ekstrakten vil stige i løbet af dialyse (fx til EDTA udvinding op til 40% volumen stigning). Omfanget af den kemiske fjernelse ved dialyse kan bestemmes ved måling af pH i prøven før og efter dialyse. Alternativt ledningsevnemålinger af dialyse vand viser omfanget af ion fjernelse.
At opnå ALE fra de samlede ekstraheret EPS (trin 1.6 og 2) dialyse trin er valgfrit. Alligevel dialyse har tre fordele: det reducerer mængden af HCI nødvendig til udfældning, det forbedrer syren massetransport i ekstrakten og nedsætter askeindholdet af det opnåede ALE. Til udfældning af ALE anbefales det at anvende et bægerglas med et meget større volumen end ekstraktiont. Na 2CO 3 normalt overdosed i ekstraktionen. Den tilsatte HCI vil først reagere med Na 2 CO 3 har i ekstrakten, hvilket resulterer i kuldioxid dannelse og, hvis prøven ikke blev dialyseret før, i opskumning. Under tilsætningen af HCl, bør ekstrakten omrøres langsomt med en magnetisk omrører af samme størrelse som bunden af bægerglasset. En omrører af denne størrelse og langsom omrøring vil resultere i endnu blanding uden at bryde strukturen af bundfaldet. Hvis sure gel klumper dannes i ekstraktet, skal bægeret bevæges rundt svagt med hånden. Fældningen udføres med en syre koncentration på 1 M for at undgå et stort volumen forøgelse af ekstrakten mens der stadig opnås en homogen fordeling af syren i prøven. Højere syrekoncentrationer kan resultere i en regional pH fald og sure gel klumper formation. En pH lavere end 2,0 nedsætter mængden af ALE, der kan inddrives, sandsynligvis på grund af strukturelle ændringeraf polymererne ved lavere pH. Det er derfor vigtigt at holde den endelige pH ved 2,20 ± 0,05.
Begrænsninger
Den ALE ekstraktionsfremgangsmåde formål at udvinde strukturelle ekstracellulære polymerer af EPS fra AGS eller biofilm i almindelighed og er ikke beregnet til at udtrække alle nuværende EPS. For at udpakke alle EPS, er det nødvendigt med en kombination af mere end én ekstraktion metode. Som vist med stigningen i udbyttet VS EPS ved at anvende en dobbelt og firdobbelt udvinding, en enkelt ekstraktion vil ikke udpakke alle strukturelle EPS. ALE ekstraktion er en barsk EPS ekstraktionsmetode, der kombinerer konstant blanding med varme og alkaliske betingelser. Af denne grund er det muligt, at nogle intracellulære materiale ekstraheres sammen med EPS. Selvom cellelysis kan være forårsaget af fysiske og kemiske udvinding teknikker (lydbehandling 31,32, NaOH 31,32, EDTA 11,32, CER 32, varme 32 og høj forskydningshastigheder ved mixing 19), skal stadig verificeres tilstedeværelsen af intracellulært materiale i genvundne EPS. Den ioniske geldannende egenskab af de udtrukne EPS er det vigtigste fokus for denne forskning, uanset om den genvundne EPS indeholder intracellulært materiale blev ikke analyseret. Fremtidig forskning vil fokusere på at identificere intracellulært materiale i de udtrukne EPS.
Solubilisering hydrogelmatriksen af AGS er afgørende at udtrække strukturelle EPS
EPS danner en tæt og kompakt hydrogel matrix i AGS. Selvom EPS indeholder forskellige klasser af organiske makromolekyler, såsom polysaccharider, proteiner, nukleinsyrer, (phospho) lipider, humusstoffer og nogle intercellulære polymerer 7,5,8, ikke alle af dem danner en gel. Kun de geldannende polymerer her betragtes som strukturelle polymerer i EPS.
Formålet med EPS ekstraktioner er først at opløse EPS og derefter at samle de solubiliserede EPS. Hvis de strukturelle EPS (dvs. than EPS dannes en hydrogel) er målet for ekstraktionen, gelmatrixen af AGS skal solubiliseres først. Kun metoder, der kan solubilisere gelmatrixen er i stand til at ekstrahere strukturelle EPS. I denne forskning, nogle ofte anvendte EPS ekstraktionsmetoder såsom centrifugering 10 – 15 lydbehandling 10,14,15, EDTA 10 – 12,14,15, formaldehyd + NaOH 10 – 15 og formamid + NaOH 13 ikke effektivt kunne isolere den strukturelle EPS. Dette skyldes det faktum, at hydrogelmatriksen af de aerobe granuler ikke blev solubiliseret ved disse fremgangsmåder. Derfor blev stabilitetstest i afsnit 4 kun udføres med betingelser til stede i EDTA, formamid + NaOH og formaldehyd + NaOH udvinding. Disse tre ekstraktioner var ikke i stand til at isolere strukturelle EPS, men stadig opnås den højeste VS EPS udbytte udover Na 2CO 3 ekstraktion. betingelser of Na 2 CO 3 ekstraktion blev ikke anvendt, da denne ekstraktion metode klart opløst AGS matrix. Derfor de anvendte forhold under stabilitet testen blev anset for repræsentative.
Ekstraktion med kationbytterresin (CER), en anden hyppigt anvendt EPS ekstraktionsmetode, blev ikke anset for denne sammenligning, som tidligere undersøgelser om EPS ekstraktion med CER ikke gav bedre resultater end de kemiske ekstraktioner anvendt her.
Geldannende EPS i AGS
Geldannende EPS betragtes som de strukturelle EPS i hydrogelmatriksen af AGS. Det er værd at påpege, at der er forskellige former for hydrogeler såsom ioniske geler, temperatur-induceret geler og pH inducerede geler. Denne undersøgelse kun fokuserer på EPS, der danner ioniske geler. Med hensyn til den store del af strukturelt gel materiale udvundet, er dette sandsynligvis være den dominerende strukturelle EPS. Der er helt sikkert muligheder, andre former for EPSat danne andre former for hydrogeler (fx pH inducerede gel 28) findes i den samme eller en anden type aerobe granuler. Ikke desto mindre, uanset hvilken form for hydrogel er målrettet, opløseliggørelse EPS gel matrix er det vigtigste skridt til at udtrække geldannende EPS.
I øjeblikket har lidt forskning blevet udført på strukturelle EPS granulært slam. ALE-ekstraktion er beskrevet i denne protokol er i stand til at ekstrahere geldannende EPS fra AGS og vil blive anvendt i fremtidige undersøgelser til karakterisering strukturelle EPS. Mere forskning skal gøres på AGS, strukturelle EPS og ikke-strukturelle EPS til bedre at forstå processen og funktion af granulering og EPS. Især følgende tre punkter skal undersøges: Hvorfor mikroorganismer producerer sådan en stor mængde af EPS, hvad der er den præcise sammensætning af EPS og hvordan sammensætningen af EPS ændres ud miljøændringer. Afsløring og analysere alle involverede forbindelser og deres interactions vil hjælpe til at forstå biofilm og hvordan man bruger dem til vores fordel.
The authors have nothing to disclose.
This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW – Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.
250 ml baffled flask | Kimble | 25630-250 | |
1000 ml glass beaker | VWR | 213-1128 | |
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer | IKA | 3810000 | |
sodium carbonate decahydrate | Merck KGaA | 1063911000 | |
50 ml centrifugation tubes | greiner bio-one | 227261 | |
Multifuge 1 S-R, centrifuge | Heraeus/Thermo Scientific | – | |
hydrochloric acid, 37 % | Sigma-Aldrich | 30721-1L-GL-D | |
250 ml glass beaker | VWR | 213-1124 | |
calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 1023821000 | |
1 ml Pasteur Pipette | Copan | 201C |