Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b
Summary
Die Wechselwirkung zwischen HCN-Kanäle und deren Hilfsuntereinheit als ein therapeutisches Ziel in der Major Depressive Disorder identifiziert worden. Hier wird eine Fluoreszenzpolarisationsgestütztes Verfahren zur Identifizierung von Kleinmolekül-Inhibitoren dieser Protein-Protein-Interaktion, dargestellt.
Abstract
Hyperpolarisations-aktivierte cyclische Nukleotid-gesteuerten (HCN) Kanäle ubiquitär im Gehirn exprimiert wird, wo sie dazu dienen, die Erregbarkeit von Neuronen zu regulieren. Die subzelluläre Verteilung dieser Kanäle in Pyramidenneuronen des Hippocampus CA1 wird von Tetratricopeptid repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), eine Hilfsuntereinheit geregelt. Genetische Knockout von HCN porenbildenden Untereinheiten oder TRIP8b, beide führen zu einem Anstieg der Antidepressiva-ähnliche Verhalten, was darauf hindeutet, dass die Funktion der HCN-Kanäle zu begrenzen als Behandlung nützlich sein können für Major Depressive Disorder (MDD). Trotz erheblicher therapeutischen Interesse sind HCN-Kanäle auch im Herz, wo sie Rhythmik regulieren. off-target Probleme mit blockierenden kardialen HCN Kanälen unserem Labor wurde das Targeting Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN und TRIP8b um kürzlich assoziiert zu umgehen vorgeschlagen, um spezifisch HCN Kanalfunktion im Gehirn stören.TRIP8b bindet an HCN Porenuntereinheiten an zwei verschiedene Wechselwirkungsstellen bilden, wobei hier die Konzentration auf die Wechselwirkung zwischen dem tetratricopeptide repeat (TPR) Domänen von TRIP8b und dem C-terminalen Schwanz von HCN1 ist. In diesem Protokoll eine erweiterte Beschreibung eines Verfahrens zur Reinigung von TRIP8b und einen hohen Durchsatz Bildschirm zu identifizieren niedermolekularen Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen HCN und TRIP8b Ausführung beschrieben. Das Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening verwendet eine Fluoreszenzpolarisation (FP) -basierte Assay die Bindung eines großen TRIP8b Fragment mit einem Fluorophor-markierten elf Aminosäuren langes Peptid entsprechend dem C HCN1 terminalen Schwanz zu überwachen. Diese Methode erlaubt "Treffer" Verbindungen in der Polarisation des emittierten Lichts identifiziert basierend auf der Änderung werden. Validierungstests werden dann vorgenommen, um sicherzustellen, dass "Hit" Verbindungen sind nicht artifactual.
Introduction
Hyperpolarisation-aktivierte zyklische Nukleotid-gesteuerten (HCN) Kanäle werden im Herzen und im zentralen Nervensystem exprimiert , wo sie bei der Regulierung der Membran Erregbarkeit 1 eine wichtige Rolle spielen. HCN – Kanäle wurden in der Pathogenese von Major Depressive Disorder (MDD) 2, verwickelt , die mehrere Gruppen geführt hat, vorzuschlagen , dass HCN Kanalfunktion pharmakologisch Begrenzung für MDD 3 als neuartige Behandlung wirksam sein kann. Jedoch ist HCN – Kanäle direkt Targeting nicht lebensfähig aufgrund ihrer wichtigen Rolle bei der kardialen Aktionspotentials 4. Ivabradin, die einzige FDA HCN Kanalantagonist genehmigt, ist für die Behandlung von Herzinsuffizienz und 5 eine Bradykardie – Effekt zu erzeugen. Als solches besteht ein Bedarf für pharmakologische Mittel, die HCN-Kanal Funktion ausschließlich im Zentralnervensystem zu begrenzen.
Tetratricopeptid wiederholen haltigen Rab8b interacting protein (TRIP8b) ist ein Gehirn spezifischeFic Hilfsuntereinheit von HCN – Kanäle, die die Oberflächenexpression und Lokalisierung von HCN – Kanäle 6,7 steuert. Genetische Knockout von TRIP8b führt zu einer Verringerung der Gehirn HCN – Kanäle 7 ohne 8 HCN – Expression im Herzen zu beeinflussen. Interessanterweise verbringen TRIP8b Knockout – Mäuse weniger Zeit unbeweglich auf der Forced Swim Aufgabe und Schwanz Suspension Aufgabe 7, zwei häufig verwendete Screening – Tests für antidepressive Wirksamkeit 11.09. Diese Ergebnisse legen nahe, dass nicht direkt HCN-Kanäle mit einem kleinen Molekül-Antagonisten von HCN Kanalfunktion Targeting, Störung der Wechselwirkung zwischen TRIP8b und HCN kann ausreichend sein, Antidepressiva-ähnliche Verhalten zu erzeugen.
TRIP8b bindet an zwei verschiedene Bindungsstellen zu HCN. Die zyklische Nukleotid – Bindungsdomäne (CNBD) von HCN in Wechselwirkung mit einer konservierten Domäne von TRIP8b befindet sich N – terminal zu den TPR – Domänen von TRIP8b 12,13. Obwohl die Rückstände des CNBD, die daran beteiligt sind,Interaktion 14 zugeordnet wurden, die Region TRIP8b, die beteiligt ist hat sich über eine-80-Aminosäurefragment verengt 13 nicht. Eine zweite Wechselwirkung tritt zwischen den tetratricopeptide Repeat (TPR) Domänen von TRIP8b und dem C – terminalen Tripeptid von HCN ( 'SNL' in HCN1-, HCN2 und HCN4, aber "ANM" in HCN3) 3,12. Die vor kurzem gelöst Kristallstruktur 15 dieser C Schwanz Interaktion ergab erhebliche strukturelle Ähnlichkeit mit der Wechselwirkung zwischen dem peroxisomale Importrezeptor, Peroxin 5 (PEX5) und ihren Partnern interagieren, Typ – 1 – peroxisomale Targeting – Sequenzen (PTS1) 16 enthält.
Obwohl beide Wechselwirkungsstellen für HCN Kanalfunktion erforderlich sind, dient die Wechselwirkung zwischen den TPR-Domänen von TRIP8b und dem C-terminalen Tripeptid von HCN1 als dominante Bindungsstelle und reguliert HCN Oberflächenexpression. Daher wurde diese Wechselwirkung als Targeting Stelle in diese Studie ausgewählt.Für den Rest des Manuskripts, als ein Hinweis auf die Wechselwirkung zwischen TRIP8b und HCN hergestellt wird, ist es diese Wechselwirkung, auf die verwiesen wird. Diese Interaktion wird durch ein hoch lösliches Fragment von TRIP8b entsprechend seiner konservierten C – Terminus mit den TPR – Domänen für die Bindung des C – terminalen Schwanz von HCN (Reste 241-602 der 1a-4 – Isoformen von TRIP8b) 3 erforderlich rekapituliert.
Um einen hohen Durchsatz Bildschirm zu identifizieren , kleine Moleküle zu stören diese Interaktion fähig zu entwickeln, eine Fluoreszenzpolarisation (FP) -basierte Assay 17 eingesetzt wurde. Fluoreszenzpolarisation basieren auf der Anregung eines Fluorophors-markierten Liganden mit polarisiertem Licht und Messen der Polarisationsgrad des emittierten Fluoreszenz 18. In Gegenwart eines Bindungspartners wird die Drehbewegung des fluoreszierenden Liganden beschränkt und polarisiertes Licht 19 emittiert. In Abwesenheit eines Bindungspartners, ter eine Drehbewegung des Liganden führt zur Emission von depolarisierten Lichts.
In dem beigefügten Protokoll wird ein Verfahren zur Reinigung von N-Terminal-markierten (6xHis) TRIP8b (241-602) unter Verwendung von Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA) -Perlen dargestellt. Ein ähnliches Protokoll wurde verwendet , um die Glutathione-S-Transferase (GST) -markierte C – terminalen 40 Aminosäuren von HCN1 (HCN1 c40) in Schritt 7 des verwendeten Protokolls zu reinigen. Aus Platzgründen wurde eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens verzichtet.
In den Schritten 2 bis 7 des Protokolls, ein Screening mit hohem Durchsatz Workflow dargestellt (siehe Abbildung 1). Protein-Protein – Wechselwirkungen sind ein notorisch schwieriges Ziel für Hochdurchsatz – Screening und Leser wird empfohlen, auf dem 20 Thema zusätzliche Ressourcen zu suchen.
Die Schritte 2 und 3 des Verfahrens charakterisieren die di – vitro – Affinität des gereinigten TRIP8b (241-602) konstruieren fora Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -markierten elf Aminosäuren langes Peptid an das C entsprechenden terminalen Schwanz von HCN1 (HCN1 FITC). Auf der Basis der Kristallstruktur des TRIP8b-HCN – Komplex 15, diese elf Aminosäuresegment ist ausreichend mit TRIP8b (241-602) zu erzeugen , zu binden. In Schritt 2 wird die K d der Wechselwirkung , gemessen durch TRIP8b (241-602) in einer festen Konzentration von HCN1 FITC titrieren. In Schritt 3 verwendet eine unbeschriftete Version des HCN – Peptid in Schritt 2 in einer festen Konzentration von sowohl TRIP8b (241-602) und HCN1- FITC titriert , um zu untersuchen , ob die FITC – Tag mit Bindung stört. Diese Versuche sind wesentlich , um die entsprechenden Konzentrationen von TRIP8b Auswählen (241-602) und HCN1 FITC im Hochdurchsatz – Screening verwendet.
Die Prämisse des Hochdurchsatz – Screening ist , dass ein kleines Molekül, das die Wechselwirkung zwischen TRIP8b stören (241-602) und HCN1- FITC einen Dezember produzierenrease im polarisierten Licht. In Schritt 4 wird der Z – Faktor des Assays 21 für eine gegebene Konzentration von TRIP8b (241-602) und HCN1 FITC sicherzustellen berechnet , dass der Assay für die Hochdurchsatz – Screening (Schritt 5) geeignet ist. Schritte 6 und 7 Validierungstests zu bestätigen sind , dass die in der primären Hochdurchsatz – Screening identifizierten Hits wirken durch die Wechselwirkung zwischen TRIP8b stören (241-602) und HCN1- FITC und nicht über einen unspezifischen Mechanismus. In Schritt 6 Carboxytetramethylrhodamin (TAMRA) -markierten HCN1 Peptid (HCN1 TAMRA) ist in einer ansonsten identischen Fluoreszenzpolarisationsassay verwendet , um fluoreszierende Verbindungen Filter, der die FP – Assay unter Verwendung des FITC – Tag kompromittieren. Schritt 7 verwendet einen größeren HCN1 C terminales Fragment (HCN1 C40) und verwendet einen bead-based Proximity Assay, der auf der "Tunneling" eines Singulett – Sauerstoff von einem Spender bead auf einen Akzeptor bead nahe Proteine miteinander in Wechselwirkung gebracht basiert 22.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wegen ihres Potenzials als ein therapeutisches Ziel in MDD 24 hat es in pharmakologischen Ansätzen beträchtliches Interesse , die HCN – Kanal Funktion im Zentralnervensystem 4 antagonisieren. Allerdings haben diese Bemühungen durch die wichtige Rolle der HCN – Kanäle in der Herzschrittmacher und das Risiko einer Arrhythmie 25 installiert. Wir schlussfolgerten , dass die Interaktion zwischen HCN zu stören und sein Gehirn spezifische Hilfsuntereinheit, TRIP8b 8, ausreichend…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. and D.M.C.), and National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). A part of this work was performed by the Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) at the Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), which is funded by the Chicago Biomedical Consortium with support from the Searle Funds at the Chicago Community Trust and Cancer Center Support Grant P30 CA060553 from the National Cancer Institute awarded to the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center. The high throughput screen work was performed in the High Throughput Analysis Laboratory which is also a core facility of the Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |
| Dialysis cassette | ThermoFisher | 66456 | |
| Isopropyl b-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502-1G | |
| 384 Well Black plate | Corning | 3820 | |
| Proxiplate | Perkin-Elmer | 6008289 | |
| Anti-GST Acceptor beads | Perkin-Elmer | 6760603C | |
| NiChelate | Perkin-Elmer | AS101D | |
| pGS21-a | Genscript | SD0121 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Coomassie Kit | ThermoFisher | 23200 | |
| Protein concentrator | ThermoFisher | 88527 | |
| Perkin Elmer Enspire Multimode Plate reader | Perkin-Elmer | #2300-001M | |
| BL21 (DE3) Competent Cells | Agilent | 200131 |
Riferimenti
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