효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향
Summary
Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.
Abstract
소분자 약물 발견과 같이, 펩티드 작동 선별하여 농도 – 반응 곡선을 생성하는 펩티드의 일련의 희석을 필요로한다. 펩티드를 스크리닝 종래 팁 기반 시료 처리 방법을 통해 흡착 펩티드 손실 증가 된 기회를 제공 plasticware 큰 표면적에 노출 펩티드로 복잡한 계층을 제공한다. plasticware 과도한 노출을 방지하는 플라스틱에 대한 밀착성을 통해 펩티드 손실을 감소시키고, 따라서 효능 예측의 부정확성을 최소화하고, 우리는 이전 펩티드 작동 (1)의 시험 관내 높은 처리량 스크리닝 분배 비접촉 탄성의 장점을 설명하고있다. 여기서는 마우스 글루카곤 유사 펩타이드 -1 수용체 (GLP-1R)에 펩티드 작동 스크리닝의 예를 이용하여 마이크로 타이 터 플레이트 펩티드 계열 희석 비접촉 탄성 제조 완전히 통합 된 자동화 솔루션을 논의한다. 우리의 방법은 높은 허용-throughput 작용제에 대한 화면을 분석 세포 기반 쉽게 증가 시료 처리를 지원하기 위해, 또는 (기타 표적 세포주 패널, 예) 분석 플레이트 사본 수가 증가를 허용하도록 확장 가능하다.
Introduction
GLP-1R은 제 2 형 당뇨병 (2)의 처리에서 설정된 약물 표적이다. 이 수용체에 대한 천연 펩티드 작용제, GLP-1은 2-3 분 (3)의 생체 내 반감기를 갖는다. 아데 닐 레이트 사이 클라 제의 활성화에 네이티브 G 단백질의 커플 링을 통해 제 메신저는 cAMP의 하류 생산의 G 단백질 결합 수용체 표적 결과 GLP-1의 결합. 축적 된 캠프의 측정은 강력한 분석 수용체 활성화를 모니터링하고 선호하는 물리 화학적 특성을 가진 활성 GLP-1 유사체에 대한 선별을 제공합니다. 이러한 분석은 농도 – 반응 곡선을 구성하기 시험 샘플의 일련의 희석을 필요로하고, 펩티드 샘플 나눠 때 특히 복잡하다. 팁 기반 일련 희석 준비에서 잠재적 인 오류는 이전에 1,4,5 설명 하였다. 펩타이드는 신뢰할 수없는 힘 추정 결과, plasticware에 흡착됩니다. 펩티드 손실 t 통해 최소화 될 수있다그는 소 혈청 버퍼에서 알부민 (BSA)와 실리콘 처리 plasticware의 사용, 아직 결합 단백질의 포함은 예측할 수없는 남아 있습니다. 특히, 실험 용기에 GLP-1의 결합의 편차가 6을 설명 하였다. 수성 분석 완충액으로 팁, 마이크로 타이 터 플레이트에서 침출 단백질 기능 (7, 8)을 방해 할 수 실험실 plasticware에 사용 된 안정 화제의 또 다른 합병증이있다. 따라서, 방법 plasticware 노출을 감소시키기는 측정의 정확성을 증가시킬 필요가있다.
어쿠스틱 액체 디스펜서 인접 분석 플레이트 (9)로 정밀한 나노 리터 액적 토출의 결과, 유체 시료의 표면에 고주파 음향 신호를 집중한다. 탄성 분사의 사용은 제조 및 대형 합성 화합물 라이브러리의 스크리닝을위한 제약 산업 표준 및 기술은 잘 작은 molecul 대한 검증되었습니다에스 10. 우리의 지식, 우리는 재조합 및 합성 펩타이드의 제조를위한 음향 분배를 설명하는 첫 번째 그룹이며, 우리는 이전에 기존의 팁 기반의 방법 1에 비해 향상된 정확도를보고했다.
이 문서에서는 완전히 자동화 된 플레이트 처리 로봇 시스템에 비접촉 음향 전송에 의한 펩타이드 직렬 및 직접 희석의 준비의 통합을 설명합니다. 샘플 음향 전달을 감싸는 다수의 방법은 이전에 11 설명되었다. 우리는 2 단계 방법의 중간 스톡 농도를 준비하고 직렬의 전체 용량 – 반응 곡선의 생성에 대한 펩타이드 유사체 희석을 이용한다. 제조 된 펩타이드는 세포를 대상 마우스 GLP-1R 발현과 함께 배양하고, 우리는 펩티드 작동 제의 액티브의 판독 이러한 세포 내에서의 cAMP 축적을 측정하기 위해, 시판 균질 시간 – 분해 형광 (HTRF) 분석을 사용하여성만. 상기 분석은 견고하고 높은 처리량 384- 웰 포맷 의무 일상적 모두 분석법 개발에 적용되는 약물 스크리닝 (12)을 투사한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 직렬 샘플의 1 μl를 필요로하는 3 × 106의 농도 범위 펩티드 시료를 희석하는 자동 분배 탄성의 성공적인 적용을 설명한다. 이 방법의 가장 큰 장점은 일반적으로 시약 전송 및 믹싱에 필요한 실험 용기 (예 : 피펫 팁 등) plasticware에 샘플 감소 노출을 통해 plasticware에 펩타이드의 흡착을 최소화를 통해 데이터 품질을 높이는 것입니다. 탄성 분배 완전히 plasticware의 사용을 배제…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
None.
Materials
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
| GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control' |
| Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
| 100X peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
| Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
| Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
| Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
| Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
| Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
| ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
| Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
| MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
| EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |
Riferimenti
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