Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

Summary

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Abstract

Tal como acontece com a descoberta de drogas de molécula pequena, o rastreio de agonistas peptídicos requer a diluição em série de péptidos para a produção de curvas de concentração-resposta. Rastreio péptidos proporciona um nível adicional de complexidade como métodos de manuseamento de amostras ponta baseada convencionais expor péptidos a uma grande área de superfície de utensílios de plástico, proporcionando uma maior oportunidade para a perda de péptido através de adsorção. Evitar a exposição excessiva aos utensílios de plástico reduz a perda de péptido através de aderência a plásticos e, portanto, minimiza a imprecisões na previsão de potência, e que descrevemos anteriormente os benefícios de acústica não-contacto para distribuir in vitro de rastreio de alto rendimento de agonistas peptídicos ^1. Aqui nós discutimos uma solução de automação totalmente integrado para a preparação de não-contacto acústico de diluições em série de péptidos em placas de microtitulação, utilizando o exemplo de rastreio de péptidos agonistas no receptor de peptídeo-1 semelhante ao glucagon de ratinho (GLP-1R). Nossos métodos permitem em altaOs ensaios para o rastreio de agonistas -throughput célula com base e são facilmente escalável para suportar aumento de produção da amostra, ou para permitir o aumento do número de cópias da placa de ensaio (por exemplo, por um painel de mais linhas de células-alvo).

Introduction

O GLP-1R é um alvo de droga estabelecida no tratamento de diabetes tipo ² 2. O agonista do péptido nativo para este receptor, o GLP-1, tem uma semi-vida in vivo de 2-3 min ^3. A ligação do GLP-1 aos seus receptores alvo resultados acoplados a proteína G na produção a jusante do segundo mensageiro cAMP através do acoplamento à proteína G nativa para a activação da adenilil-ciclase. A medição do AMPc acumulado proporciona um ensaio robusto para monitorizar a activação do receptor e para o rastreio de activos análogos de GLP-1 com propriedades físico-químicas preferidas. Um tal ensaio requer a diluição em série de amostras de ensaio para a construção de curvas de concentração-resposta, e isto é particularmente complicado quando distribui amostras de péptidos. Possíveis erros de preparação diluição em série ponta baseada foram previamente descritos ^1,4,5. Peptídeos será adsorvido pelas plasticware, resultando em estimativas de potência não confiáveis. perda de peptídeo pode ser minimizado através de tele inclusão de albumina de soro bovino (BSA) em tampões e a utilização de utensílios de plástico siliconizado, ainda de ligação da proteína permanece imprevisível. Em particular, a variação na ligação de GLP-1 para recipientes experimentais foi descrito ^6. Há uma complicação adicional em que os agentes de estabilização utilizados na plasticware laboratório podem contaminar a partir de dicas e placas de microtitulação em buffers de ensaio aquosas e interferir com a função da proteína ^{7, 8.} Portanto, métodos para reduzir a exposição a plasticware são necessárias para aumentar a precisão das medições.

Acústicos dispensadores de líquidos concentrar um sinal acústico de alta frequência sobre a superfície de uma amostra de fluido, o que resulta na ejecção de gotículas nanolitros precisos em uma placa de ensaio adjacente ^9. O uso de ejeção acústica é padrão na indústria farmacêutica para a preparação e triagem de grandes bibliotecas de compostos sintéticos, ea tecnologia tem sido bem validada para pequenas molecules ^10. Para o nosso conhecimento, nós somos o primeiro grupo a descrever distribuição acústico para a preparação de péptidos recombinantes e sintéticos e temos relatado anteriormente a precisão melhorada em comparação com métodos baseados em ponta convencionais ^1.

Este artigo descreve a integração da preparação de peptídeos diluições em série e diretas por transferência acústica sem contato para um manuseamento placa sistema robótico totalmente automatizado. Um número de métodos que englobam transferência acústica de amostras foram descritos anteriormente ^11. Nós utilizamos um método de dois passos para preparar as concentrações de banco de intermediários e para diluir em série análogos de péptidos para a geração da curva de dose-resposta completa. Os péptidos assim preparados são incubados com células que expressam o rato alvo de GLP-1R, e usamos um ensaio disponível comercialmente homogénea de fluorescência resolvida no tempo (HTRF) para medir a acumulação de cAMP dentro destas células como uma leitura de Activ agonistas peptídicosdade. O ensaio é robusto e propícios a um formato de alto rendimento de 384 poços e rotineiramente aplicada tanto para o desenvolvimento e ensaio de rastreio de fármacos projecta ^12.

Protocol

1. Peptide Diluição Serial Preparar tampão de ensaio: Hanks tamponado com solução de sal (HBSS), suplementado com HEPES 25 mM, 0,1% de BSA e 3 mM-isobutil-1-metilxantina 0,5 (IBMX), pH 7,4. Usar um distribuidor de reagente de grandes quantidades para adicionar sistematicamente 5 uL de tampão de ensaio a cada poço de cinco placas de 384 poços de baixo volume de ensaio de. Use software interno para criar um programa de distribuição de 5 ul volume de adição a cada poço de uma plac…

Representative Results

Rotineiramente usar um método de duas etapas para diluir péptidos por via de transferência acústica. Para a primeira etapa, um distribuidor acústico alinhada com a automação é usado para criar quatro peptídicos intermediários da diluições através de duas placas de código (Figura 1a, b). Para o segundo passo, utiliza-se um distribuidor acústico para diluir ainda mais diluições imagens de placas de origem A e B para criar um interval…

Discussion

Este protocolo descreve a aplicação bem sucedida de distribuição automatizada acústico para diluir em série amostras de péptido ao longo de um intervalo de concentrações de 3 x 10 ⁶ necessitando de menos de 1 ml de amostra. A principal vantagem deste método é o de aumentar a qualidade dos dados através de minimizar a adsorção de péptidos para utensílios de plástico através da exposição reduzida das amostras experimentais para recipientes e utensílios de plástico (tais como pontas de pipe…

Materials

Hanks’ Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide	Bachem	H-6795	Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control'
Test peptides	Produced in-house at MedImmune		Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100X peptide stock	Produced in-house at MedImmune		Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Cedex XS Cell Analyzer	Innovatis
Corning 384 well plates, low volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate	Labcyte Inc.	P-05525
Echo Qualified Reservoir	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer