Automatizado de dispensación acústica para la dilución en serie del péptido Los agonistas de la potencia Ensayos de Determinación

Summary

Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.

Abstract

Al igual que con el descubrimiento de fármacos pequeña molécula, el cribado de agonistas de péptidos requiere la dilución en serie de péptidos para producir curvas de concentración-respuesta. Screening péptidos proporciona una capa adicional de complejidad como los métodos de manipulación de muestra basada en la punta convencionales exponen péptidos a una gran superficie de material de plástico, proporcionando una mayor oportunidad para la pérdida de péptido a través de la adsorción. La prevención de la exposición excesiva a recipientes de plástico reduce la pérdida de péptido a través de la adhesión a los plásticos y por lo tanto minimiza las imprecisiones en la predicción de la potencia, y se han descrito anteriormente los beneficios de la acústica de no contacto de dispensación para cribado de alto rendimiento in vitro de agonistas de péptido ^1. Aquí hablamos de una solución de automatización totalmente integrado para la preparación de no contacto acústico de diluciones en serie de péptidos en placas de microtitulación utilizando el ejemplo de la detección de agonistas peptídicos en el péptido similar al glucagón-1 receptor de ratón (GLP-1R). Nuestros métodos permiten altaLos ensayos para la detección de agonistas -throughput basados en células y son fácilmente escalable para soportar el aumento de rendimiento de la muestra, o para permitir el aumento del número de copias placa de ensayo (por ejemplo, para un panel de más líneas de células diana).

Introduction

El GLP-1R es una diana de fármaco establecido en el tratamiento de la diabetes tipo 2 ^2. El agonista de péptido nativo para este receptor, GLP-1, tiene una in vivo la vida media de 2 a 3 min ^3. La unión de GLP-1 a sus acoplados a proteínas G resultados receptor diana en la producción corriente abajo de la segunda mensajero AMPc a través de acoplamiento nativo proteína G a la activación de la adenilato ciclasa. La medición de la cAMP acumulado proporciona un sólido ensayo para controlar la activación del receptor y para la detección de activos análogos de GLP-1 con propiedades físico-químicas preferidas. un ensayo de este tipo requiere la dilución en serie de muestras de ensayo para construir las curvas de concentración-respuesta, y esto es particularmente complicada cuando se entrega muestras de péptidos. Los errores potenciales de preparación de la dilución en serie basada en la punta se han descrito anteriormente ^1,4,5. Los péptidos se adsorben a recipientes de plástico, lo que resulta en estimaciones de potencia poco fiables. pérdida de péptido puede ser minimizado a través de tque la inclusión de la albúmina de suero bovino (BSA) en tampones y el uso de recipientes de plástico siliconado, sin embargo, la proteína de unión sigue siendo impredecible. En particular, la variación en la unión de GLP-1 a recipientes experimentales se ha descrito ^6. Existe una complicación adicional en la que los agentes de estabilización utilizados en recipientes de plástico de laboratorio pueden filtrarse desde las puntas y las placas de microtitulación en tampones de ensayo acuosas e interferir con la función de la proteína ^{7, 8.} Por lo tanto, los métodos para reducir la exposición a los recipientes de plástico son necesarios para aumentar la precisión de las mediciones.

Dispensadores de líquido acústicos centran una señal acústica de alta frecuencia sobre la superficie de una muestra de fluido, dando como resultado la expulsión de gotitas de nanolitros precisas en una placa de ensayo adyacente ^9. El uso de eyección acústica es estándar en la industria farmacéutica para la preparación y selección de grandes bibliotecas de compuestos sintéticos, y la tecnología ha sido bien validado para pequeñas moleculES ^10. Hasta donde sabemos, somos el primer grupo de distribución para describir acústica para la preparación de péptidos recombinantes y sintéticos y hemos informado anteriormente de la exactitud mejorada en comparación con los métodos convencionales basados en la punta ^1.

En este artículo se describe la integración de la preparación de diluciones en serie de péptidos y directos por transferencia acústica sin contacto sobre una placa de manipulación robótica sistema totalmente automatizado. Una serie de métodos que comprenden la transferencia acústica de las muestras se han descrito anteriormente ^11. Utilizamos un método de dos etapas para preparar las concentraciones de valores intermedios y para diluir en serie análogos de péptidos para la generación de la curva dosis-respuesta completa. Los péptidos preparados se incuban con las células que expresan el ratón diana GLP-1R, y que utilizan un ensayo disponible comercialmente homogénea de fluorescencia resuelta en el tiempo (HTRF) para medir la acumulación de cAMP dentro de estas células como una lectura de activ agonistas peptídicosdad. El ensayo es robusto y es susceptible de un alto rendimiento formato de 384 pocillos y se aplica de forma rutinaria tanto para el desarrollo y ensayo de detección de drogas proyecta ^12.

Protocol

1. Péptido dilución en serie Preparar tampón de ensayo: solución salina tamponada Hanks (HBSS) suplementado con HEPES 25 mM, 0,1% de BSA y 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), pH 7,4. Utilice un dispensador de reactivos a granel para añadir sistemáticamente 5 l de tampón de ensayo a cada pocillo de cinco placas de 384 pocillos de bajo volumen de ensayo. Utilice el software interno para crear un programa de dispensación para 5 l volumen de adición a cada pocillo de una placa de …

Representative Results

Como rutina usamos un método de dos pasos para diluir los péptidos a través de transferencia acústica. Para el primer paso, un distribuidor acústico alineado con la automatización se utiliza para crear cuatro diluciones intermedias de stock de péptidos a través de dos placas de origen (Figura 1a, b). Para la segunda etapa, se utiliza un distribuidor acústico para diluir aún más diluciones del stock de placas de fuente A y B para crear un…

Discussion

Este protocolo describe la aplicación exitosa de dispensación acústico automatizado para diluir en serie muestras de péptidos en un rango de concentración de 3 x 10 ⁶ que requiere menos de 1 l de muestra. La principal ventaja de este método es aumentar la calidad de los datos a través de minimizar la adsorción de péptido a recipientes de plástico a través de una menor exposición de las muestras a los contenedores experimentales y recipientes de plástico (por ejemplo, puntas de pipeta) que normalm…

Materials

Hanks’ Balanced Salt solution	Sigma-Aldrich	H8264
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9418
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	I7018	Prepared as a 0.5 M stock in DMSO
GLP-1 (7-36) amide	Bachem	H-6795	Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control'
Test peptides	Produced in-house at MedImmune		Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate
100X peptide stock	Produced in-house at MedImmune		Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Cedex XS Cell Analyzer	Innovatis
Corning 384 well plates, low volume	Sigma-Aldrich	4514
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate	Labcyte Inc.	P-05525
Echo Qualified Reservoir	Labcyte Inc.	ER-0055
Echo 550 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl
Echo 525 Liquid Handler	Labcyte Inc.		Droplet transfer volumes in increments of 25 nl
ACell Benchtop Automation	HighRes Biosolutions	MC522
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics	HighRes Biosolutions
MultidropCombi Reagent Dispenser	ThermFisher Scientific	5840300	Referred to as 'bulk reagent dispenser'
HTRF cAMP Dynamic 2 kit	Cisbio Bioassays	62AM4PEJ
EnVision Multilabel Reader	PerkinElmer