Peptide adsorption to plasticware during traditional tip-based serial dilutions can significantly impact potency determination and confound the understanding of structure-activity relationships used for lead identification and lead optimization phases of drug discovery. Here methods for automated acoustic non-contact serial dilution of peptide samples are described.
Som med lite molekyl drug discovery, screening for peptid-agonister krever seriefortynning av peptider for å produsere konsentrasjons-responskurvene. Screening peptider gir et ekstra lag av kompleksitet som konvensjonelle tip-baserte metoder for prøvehåndtering utsette peptider til et stort overflateareal på plasticware, noe som gir en øket mulighet for peptid tap via adsorpsjon. Forebygging av overdreven eksponering for plasticware reduserer peptid tap via tilslutning til plast og dermed reduserer unøyaktigheter i potens prediksjon, og vi har tidligere beskrevet fordelene av ikke-kontakt akustisk dispensering for in vitro high-throughput screening av peptid-agonister 1. Her diskuterer vi et fullt integrert automatisering løsning for ikke-kontakt akustiske fremstillingen av peptid seriefortynninger i mikrotiterplater ved anvendelse av eksempel på screening for peptid-agonister til mus glukagon-lignende peptid-1-reseptoren (GLP-1R). Våre metoder gir mulighet for høy-throughput celle-baserte analyser til skjermen for agonister og er lett skalerbar å støtte økt prøvekapasitet, eller å tillate økt antall analyseplate kopier (f.eks, for et panel bestående av flere mål cellelinjer).
GLP-1R er en etablert medikamentmål i behandlingen av type 2 diabetes to. Det native peptid agonist for denne reseptoren, GLP-1, har en in vivo halveringstid på 2-3 min 3. Bindingen av GLP-1 til dens G-protein koblet reseptor mål resultater i nedstrøms produksjon av den andre budbringer cAMP gjennom naturlig G-protein kopling til aktivering av adenylat cyclase. Måling av akkumulert cAMP gir en robust analyse for å overvåke reseptor aktivering og til skjermen for aktive GLP-1-analoger med foretrukne fysisk-kjemiske egenskaper. Et slikt assay krever seriefortynning av testprøver for å konstruere konsentrasjons-responskurvene, og dette er særlig komplisert når levere peptid prøver. Potensielle feil fra tip-basert seriell fortynning forberedelse har blitt beskrevet tidligere 1,4,5. Peptider vil adsorberes til plasticware, noe som resulterer i upålitelige potens estimater. Peptide tap kan minimeres gjennom than inkludering av bovint serumalbumin (BSA) i buffere og bruk av silikonisert plasticware, men proteinbindings fortsatt uforutsigbart. Spesielt er variasjonen i binding til GLP-1 for å eksperimentelle beholderne er beskrevet 6. Det er en ytterligere komplikasjon ved at stabiliseringsmidler som anvendes i laboratoriet plasticware kan lekke fra tips og mikrotiterplater i vandig assay-buffere og interferere med proteinfunksjon 7, 8. Derfor er fremgangsmåter for å redusere eksponeringen til plasticware er nødvendig for å øke nøyaktigheten av målingene.
Akustiske flytende dispensere fokusere et høyfrekvent akustisk signal på overflaten av en fluidprøve, noe som resulterer i utstøting av presise nanoliter dråper inn i en tilstøtende analyseplate 9. Bruken av akustiske utstøting er standard i den farmasøytiske industrien for utarbeidelse og screening av store syntetiske sammensatte bibliotekene, og teknologien har vært godt validert for liten molecules 10. Så vidt vi vet er vi den første gruppen til å beskrive akustiske levering for utarbeidelse av rekombinante og syntetiske peptider, og vi har tidligere rapportert forbedret nøyaktighet i forhold til konvensjonelle tip-baserte metoder 1.
Denne artikkelen beskriver integrering av fremstillingen av peptid serielle fortynninger og direkte ved ikke-kontakt akustisk overføring på en fullt ut automatisert håndtering av plate robotsystem. En rekke fremgangsmåter som omfatter akustisk overføring av prøver er blitt beskrevet tidligere 11. Vi benytter en to-trinns metode for å fremstille mellomliggende lager konsentrasjoner og for å serielt fortynnet peptidanaloger for generering av full dose-responskurve. De fremstilte peptider blir inkubert med celler som uttrykker en mål-mus GLP-1R, og vi benytter en kommersielt tilgjengelig homogen tidsoppløst fluorescens (HTRF) assay for å måle cAMP-akkumulering i disse cellene som en avlesning av peptid-agonist Activligheten. Analysen er robust og mottagelig for en high-throughput 384-brønners format og rutinemessig brukt til både analysen utvikling og medikamentscreening rager 12.
Denne protokollen beskriver den vellykkede anvendelse av automatiserte akustisk utleverings til serielt fortynnede peptid prøver over et konsentrasjonsområde på 3 x 10 til 6 krever mindre enn 1 ul prøve. Den store fordelen med denne fremgangsmåten er å øke datakvaliteten gjennom minimere peptid adsorpsjon til plasticware via redusert eksponering av prøvene for å eksperimentelle beholdere og plasticware (for eksempel pipettespisser) som normalt kreves for reagens overføring og blanding. Mens akustisk…
The authors have nothing to disclose.
None.
Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H8264 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Prepared as a 0.5 M stock in DMSO |
GLP-1 (7-36) amide | Bachem | H-6795 | Prepared as a 1 mg/ml stock in PBS, referred to as '100X reference control' |
Test peptides | Produced in-house at MedImmune | Supplied at various concentrations in DMSO or PBS as appropriate | |
100X peptide stock | Produced in-house at MedImmune | Test peptide diluted into assay buffer to 100X final required concentration | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
Cedex XS Cell Analyzer | Innovatis | ||
Corning 384 well plates, low volume | Sigma-Aldrich | 4514 | |
Echo Qualified 384-Well Polypropylene Microplate | Labcyte Inc. | P-05525 | |
Echo Qualified Reservoir | Labcyte Inc. | ER-0055 | |
Echo 550 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 2.5 nl | |
Echo 525 Liquid Handler | Labcyte Inc. | Droplet transfer volumes in increments of 25 nl | |
ACell Benchtop Automation | HighRes Biosolutions | MC522 | |
Cellario Lab Automation Scheduling software for Life Science Robotics | HighRes Biosolutions | ||
MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermFisher Scientific | 5840300 | Referred to as 'bulk reagent dispenser' |
HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEJ | |
EnVision Multilabel Reader | PerkinElmer |