Metoder til at undersøge lymfeknuder kirtel og hæmocytter i<em> Drosophila</em> Larver

Summary

Drosophila og pattedyr bloddannende system deler mange fælles træk, hvilket gør Drosophila en attraktiv genetisk model til at studere hæmatopoiese. Her demonstrerer vi dissektion og montering af store larver hæmatopoietisk organ for immunhistokemi. Vi beskriver også metoder til at analysere forskellige larver hæmatopoietiske rum, herunder cirkulerende hæmocytter og fastsiddende krystal celler.

Abstract

Der findes mange paralleller mellem Drosophila og pattedyr hæmatopoietiske systemer, selv om Drosophila mangler den lymfoid herkomst, der karakteriserer pattedyr adaptiv immunitet. Drosophila og pattedyr hæmatopoiese forekomme i rumligt og tidsligt adskilte faser at producere flere blodcellelinjer. Begge systemer opretholder reservoirer af blod-stamceller med til at udvide eller erstatte modne afstamninger. Det hæmatopoietiske system tillader Drosophila og pattedyr til at reagere på og tilpasse sig immune udfordringer. Vigtigere er de transkriptionelle regulatorer og signalveje, der styrer generation, vedligeholdelse og funktion af det hæmatopoietiske system bevaret fra fluer til pattedyr. Disse ligheder gør det muligt Drosophila skal anvendes til genetisk model hæmatopoietisk udvikling og sygdom.

Her er vi detalje analyser til at undersøge hæmatopoietiske system Drosophila larver. IIsær vi skitsere metoder til at måle blod celletal og koncentration, visualisere en bestemt moden afstamning in vivo, og udføre immunhistokemi på blodlegemer i cirkulation og i hæmatopoietisk orgel. Disse assays kan afsløre ændringer i genekspression og cellulære processer, herunder signalering, overlevelse, proliferation og differentiering og kan anvendes til at undersøge en række spørgsmål vedrørende hæmatopoiese. Kombineret med de genetiske værktøjer til rådighed i Drosophila, kan disse assays anvendes til at vurdere det hæmatopoietiske system ved definerede genetiske ændringer. Mens ikke specifikt beskrevet her, kan disse assays også anvendes til at undersøge effekten af ​​miljømæssige ændringer, såsom infektion eller kost, på det hæmatopoietiske system.

Introduction

De komplekse mekanismer, der regulerer transskription faktorer og signalveje, der koordinerer udviklingen af ​​det hæmatopoietiske system, og at fejl i hæmatologiske sygdomme stadig dårligt forstået. Disse transkriptionsfaktorer og signalveje, samt deres regulering, er stærkt konserverede mellem Drosophila og pattedyr hæmatopoiese ^1-5. Drosophila hæmatopoietiske system udgør således en fremragende genetisk model til at definere de molekylære mekanismer, der styrer hæmatopoiese og underliggende hæmatologiske sygdomme.

Svarende til pattedyr, Drosophila generere blodlegemer, kaldet hæmocytter, i rumligt og tidsligt adskilte faser af hæmatopoiese. Traditionelt blev Drosophila hæmatopoiese tænkt at være begrænset til faser i det embryoniske mesoderm og i larvernes lymfekirtel. Nylige undersøgelser dokumenterer, at hæmatopoiese også forekommer i larvernes siddende kosters og i den voksne maven ^6-8. Alle hæmatopoietiske faser producerer to typer af modne hæmocytter: plasmatocytes og krystal celler. Plasmatocytes er makrofaglignende celler involveret i fagocytose, medfødte immunitet, og sårheling. Krystal celler indeholder pro-phenoloxidaser kræves til melanin, en reaktion, der anvendes i insekt immunreaktioner og sårheling. Larve hæmatopoiese kan generere en tredje moden hemocyte type, der kaldes en lamellocyte, som svar på visse immune udfordringer såsom snyltehveps hveps infektion ^9,10. Lamellocytes er store, klæbende celler, der fungerer sammen med plasmatocytes og krystal celler, at indkapsle og neutralisere hveps æg lagt i Drosophila larver. I fravær af parasitization, er lamellocytes ikke fundet i vildtype-larver. Melanotiske masser ligne melanized, indkapslet wasp æg; mange mutant Drosophila-stammer udvikler melanotiske masser i fravær af parasitization. Tilstedeværelsen af ​​Lamellocytes og / eller melanotiske masserne kan være tegn af hæmatopoietiske abnormiteter. Faktisk har den melanotiske masse fænotype blevet anvendt til at identificere gener og pathways involveret i hæmatopoiese ^11-14.

Larvestadiet hæmatopoietiske system er den mest omfattende undersøgt til dato. Det består af hæmocytter cirkulerer i hemolymph, fastsiddende hemocyte klynger mønstrede under neglebånd og hæmocytter bosiddende i lymfeknuder kirtel. Den lymfekirtel er en række bilaterale lapper fastgjort til den dorsale fartøj. Hver primære Lap af lymfeknuder kirtel er inddelt i tre hovedzoner. Den yderste zone er kendt som den kortikale zone og indeholder modning hæmocytter. Den inderste zone kaldes medullære zone og består af hvilende hemocyte forstadier. Den tredje zone, den bageste signalering centrum, er en lille gruppe af celler ved basen af ​​lymfekirtel, der fungerer som en stamcelle-lignende niche. Tidligt arbejde etableret kritiske funktioner for Notch ^15-18 </sup>, Hedgehog ^19,20, JAK-STAT ^18, og Vingeløse ²¹ aktivitet til at regulere larvernes lymfe kirtel udvikling. Nyere undersøgelser har vist, at BMP ^22, FGF-Ras ^23, og Hippo ^24,25 signalering også fungere inden larve lymfekirtel.

Fire larval hæmatopoietiske assays beskrevet her beskriver 1) måling cirkulerende hemocyte koncentration, defineret som antal celler pr volumenenhed, 2) isolering og fiksering cirkulerende hæmocytter for immunhistokemi, 3) visualisere krystal celler in vivo, og 4) dissecting, fastsættelse og montering lymfekirtler for immunhistokemi. Disse assays kan anvendes som hæmatopoietiske udlæsninger at vurdere de funktioner og forskrifter signalveje i larvernes hæmatopoietiske system. Mens disse metoder, der tidligere er blevet anvendt inden for området, har visuelle dokumentation af disse assays begyndt først for nylig ^8,26-30. citeret her flere publikationer hjælpful ressourcer der beskriver lignende metoder og hæmatopoietiske markører ^26,31-33. Derudover Trol og Viking er nyttige markører for lymfeknuder kirtel basalmembranen.

Protocol

1. Cirkulerende Hemocyte Koncentration For at opnå larver af nogenlunde samme udviklingsstadiet for denne analyse, begrænser indsamling af æg ved at tillade kvinder at lægge æg for en tidsbegrænset periode af 2 – 6 timer. Indsamle larver i dissekere dish brønde fyldt med 1x phosphatpufret saltvand (PBS, tabel 1). For hver larve anbringes 10 pi 1x PBS i et mikrocentrifugerør på is og 10 pi 1x PBS på en ren dissekerende pad. Placer dissekere pad på en oplyst stere…

Representative Results

Cirkulerende Hemocyte Koncentration Hemocyte tal stige i hele larver udvikling 35. For at illustrere at denne metode bestemmes forskelle i hemocyte tal og koncentration, uanset den biologiske årsag, målte vi hemocyte koncentrationer af forsinket og ikke forsinkede larver. Tab af prothoracicotropic hormon (ptth) ved genetisk ablation af ptth-producerende neuroner (ptth> grim) producerer en forsinkelse i larvernes u…

Discussion

Ved genetisk eller miljømæssig ændring, kan de fire metoder, der er beskrevet her, kan anvendes enkeltvis eller sammen for at analysere forskellige processer under hæmatopoiese såsom signalering, overlevelse, proliferation og differentiering Drosophila hæmatopoiese er en dynamisk proces.; antallet af hæmocytter per dyr øger ³⁵ og strukturen og genekspression af lymfeknuder kirtel skifter ³² under udviklingen. Forud for udførelse af disse analyser, derfor er det vigtigt at begræns…

Materials

PBS tablets	MP Biomedicals	2810305
dissecting dish	Corning	7220-85
microcentrifuge tube	Denville	C2170
silicone dissecting pad, made from Sylgard 184 kit	Krayden (distributed through Fisher)	NC9644388 (Fisher catalog number)	Made in petri dish by mixing components of Sylgard elastomer kit according to manufacturer instructions.
stereomicroscope	Morrell Instruments (Nikon distributor)	mna42000, mma36300	Nikon models SMZ1000 and SMZ645
tissue wipe	VWR	82003-820
forceps	Electron Microscopy Sciences	72700-DZ
p200 pipette	Eppendorf	3120000054
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10227
Countess cell counting chamber slides	Invitrogen	C10283
hemocytometer	Hausser Scientific	3200
trypan blue stain	Life Technologies	T10282
formaldehyde	Fisher	BP531-500
Triton	Fisher	BP151-500
Tween 20	Fisher	BP337-500
bovine serum albumin	Rocky Mountain Biologicals	BSA-BSH-01K
normal goat serum	Sigma	G9023-10ML
normal donkey serum	Sigma	D9663-10ML
200 proof ethanol	VWR	V1001
N-propyl gallate	MP Biomedicals	102747
glycerol	VWR	EM-4750
DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole)	Fisher	62248
6-well plate	Corning	351146
12-well plate	Corning	351143
microscope cover glass, 22 mm square	Fisher	12-544-10
microscope cover glass, 18mm circular	Fisher	12-545-100
glass microscope slides	Fisher	22-034-980
thermal cycler	Eppendorf	E950010037	Mastercycler EP Gradient S
PCR tubes	USA Scientific	1402-2700
24-well plate	Corning	351147
disposable transfer pipet	Fisher	13-711-9AM
fluorescence microscope	Zeiss		Axio Imager.Z1