Experimentell infektion med<em> Listeria monocytogenes</em> Som modell för att studera värd Interferon-y Responses
Summary
Detta protokoll beskriver hur man ympa C57BL / 6J-möss med EGD stam av Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) och för att mäta interferon-γ (IFN-γ) svar genom naturliga mördarceller (NK), naturliga mördar-T (NKT-celler), och adaptiv T-lymfocyter efter infektion. Detta protokoll beskriver också hur man genomför studier överlevnads i möss efter infektion med en modifierad LD 50 dosen av patogenen.
Abstract
L. monocytogenes är en grampositiv bakterie, som är en orsak till livsmedelsburna sjukdomar hos människor. Experimentell infektion av möss med denna patogen har varit mycket informativ på sig rollen som medfödda och adaptiva immunceller och specifika cytokiner i värdimmunitet mot intracellulära patogener. Produktionen av IFN-γ genom medfödda celler under subletal infektion med L. monocytogenes är viktigt för aktivering makrofager och tidig kontroll av patogenen 1-3. Dessutom är det viktigt för grundning av aktiveringen av medfödda celler vid återinfektion 4 IFN-γ-produktion av adaptiva minneslymfocyter. L. monocytogenes infektionsmodell således fungerar som ett utmärkt verktyg för att undersöka om nya terapier som är utformade för att öka IFN-γ produktion påverkar IFN-γ svar in vivo och har produktiva biologiska effekter såsom ökad bakteriell clearance eller förbättra mus överlevnad fråninfektion. Beskrivs här är en grundläggande protokoll för hur man genomför intraperitoneala infektioner av C57BL / 6J möss med EGD stam av L. monocytogenes och för att mäta IFN-γ produktion av NK celler, NKT-celler och adaptiva lymfocyter med flödescytometri. Dessutom är förfaranden beskrivs till: (1) växa och förbereda bakterierna för ympning (2) mäta bakteriehalten i mjälten och levern, och (3) mått djuröverlevnad till endpoints. Representativa data finns också för att illustrera hur denna infektionsmodell kan användas för att testa effekten av specifika medel på IFN-y svar på L. monocytogenes och överlevnaden hos möss från denna infektion.
Introduction
IFN-γ är en cytokin som är avgörande för att förmedla immunitet mot intracellulära patogener och för att styra tumörtillväxt 5. Betydelsen av detta cytokin i bakterieresistens är uppenbar i iakttagelsen att människor med mutationer i IFN-γ signalväg är mycket mottagliga för infektion med mykobakterier och salmonella sex. På liknande sätt, mus med brist på antingen IFN-γ eller IFN-γ-receptor uppvisar defekter i resistens mot mykobakterier 7-9 och andra intracellulära patogener inklusive L. monocytogenes 10,11, Leishmania major 12, Salmonella typhimurium 13 och vissa virus 11. Förutom att bekämpa patogener, IFN-γ spelar en avgörande roll i värdförsvar mot tumörer 14. Även om högre produktion av IFN-γ är fördelaktigt i samband med infektion eller cancer, har förlängt produktion av detta cytokin kopplats to utveckling av systemisk autoimmunitet 15-17 och accelerationen av typ I-diabetes i icke-feta diabetiska musmodell 18.
De största källorna till IFN-γ inkluderar NK-celler, NKT-celler, γδ T-celler, T-hjälparce 1 (Th1) celler och cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) 5,19,20. IFN-γ förbättrar både medfödd och adaptiv immunitet efter: (1) upp-reglering av större histokompatibilitetskomplex (MHC) klass I och II uttryck, (2) att öka uttryck av samstimulerande molekyler på antigenpresenterande celler, (3) förbättra makrofag fagocytos och produktion av proinflammatoriska cytokiner och mikrobicida faktorer (t.ex., kväveoxid och reaktiva syreradikaler), (4) att främja differentieringen av naiva CD4 + T-celler i Th1 effektorceller, (5) främja antikroppsklass omkoppling till immunoglobulin ( Ig) 2a och IgG3 (i mus), (6) att inducera produktion av kemokiner att rekrytera immunceller till ställen med infection, och (7) öka NK-celler och CTL-svar 5,19. Med tanke på den avgörande betydelsen av IFN-γ i värd svar på patogener och tumörer, har rekombinant IFN-γ testats som en behandling för olika infektioner och maligniteter (översikt i 19). Men eftersom systemisk administrering av IFN-γ eller Th1 främja cytokin interleukin-12 (IL-12) är associerad med biverkningar och dosrelaterad toxicitet 19,21, det finns intresse av att utveckla alternativa strategier för att öka IFN-γ produktion av immunceller. Utveckling av nya biologiska och små molekyler kräver in vivo screening verktyg för att testa om sådana medel ökar IFN-γ produktion under ett immunsvar och om detta leder till meningsfulla biologiska effekter såsom ökningar av djuröverlevnad.
Experimentell infektion av möss med de grampositiva bakterien Listeria monocytogenes har varit en instrumental modell fördechiffrera rollen av IFN-γ i värdimmunitet mot intracellulära patogener 1,22. Infektion av möss med patogenen intravenöst eller intraperitonealt (ip) leder till en snabb spridning av bakterier till mjälten och levern, där de blir internaliseras av residenta makrofager och hepatocyter med topp bakteriella belastningar i mjälten inträffar mellan tre och fyra dagar efter avslutad infektion 1,3,22. Produktionen av IFN-γ genom NK-celler är viktig för makrofagaktivering och tidig resistens mot patogenen 3; emellertid vid höga infektiösa doser, produktionen av IFN-γ kan också vara skadlig för patogen clearance 23. NKT-celler är också en källa av IFN-γ i mjälten och levern under tidig kontroll av patogener 2,24 och denna produktion har visat sig förstärka IFN-γ-produktion genom andra celltyper inklusive NK-celler 2. Å andra sidan, senare verkande adaptiva T-lymfocyter, CD8 + T-celler i partiCular, är viktiga för förmedling avslut av patogenen och ge skydd mot återinfektion 1,4,22.
Denna infektion modell har varit attraktivt för forskare för ett antal skäl (översikt i ett). För det första är infektion med patogenen mycket reproducerbar och inducerar en stark Th1 och cellulära immunsvar. För det andra, under subletal infektion, bakteriell belastning koncentreras i levern och mjälten, där den lätt kan mätas. För det tredje kan patogenen kan säkert hanteras under biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) förhållanden. För det fjärde, organismen och immunsvar som det skapar i stor utsträckning har karakteriserats. Slutligen har en mängd av muterade och genetiskt modifierade stammar utvecklats som är tillgängliga för användning.
Beskrivs här är en grundläggande protokollet för ympning av C57BL / 6J möss med EGD stam av L. monocytogenes 25 och för att mäta IFN – γ reresponser från NK, NKT, och adaptiva lymfocyter efter infektion. Vidare beskrivs hur man mäter bakteriehalten i mjälten och levern efter subletal infektion och att genomföra studier överlevnads efter infektion med en modifierad LD 50 dosen av patogenen. Slutligen är representativa data visas hur detta protokoll kan användas för att screena effekten av nya behandlingar på IFN-y svar och mus överlevnad från L. monocytogenes infektion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för hur man genomför en grundläggande experimentell infektion med EGD stam av L. monocytogenes 25 i manliga eller kvinnliga C57BL / 6J möss. Detta protokoll upprättades för att studera effekten av en ny liten molekyl IS001 på IFN-γ produktion av medfödda och adaptiva lymfocyter in vivo 31. Genom att övervaka bakteriell clearance och överlevnad efter infektion, var insikter i hur dessa förändringar i IFN-γ påverkat värdens förmåga a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Development of this protocol was supported by an operating grant from CIHR (MOP97807) to SED.
Materials
| Brain Heart Infusion Broth, Modified | BD | 299070 | any brand should be appropriate |
| Agar | BD | 214010 | any brand should be appropriate |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | any brand should be appropriate |
| 1xPBS | Sigma | D8537 | any brand should be appropriate |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | any brand should be appropriate |
| Ammonium Chloride (NH3Cl) | any brand should be appropriate | ||
| KHCO3 | any brand should be appropriate | ||
| Na2EDTA | any brand should be appropriate | ||
| RPMI 1640 | Gibco | 22400089 | any brand should be appropriate |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12483 | Before use, heat-inactivate at 56 °C for 30 min |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | any brand should be appropriate |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140 | any brand should be appropriate |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | any brand should be appropriate |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (containing Monensin) | BD | 554724 | Use 4 μl in 6 ml cell culture |
| 16% Paraformaledehye | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% PFA in ddH20 or 1xPBS |
| 10 x Perm/Wash buffer | BD | 554723 | Dilute 10x in ddH20 |
| Fc block, Anti-Mouse CD16/CD32 Purified | eBioscience | 14-0161 | Dilute 1:50 |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience | 65-0866 | Dilute 1:1000 (we have also used viability dyes from Molecular Probes) |
| anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5) | eBioscience | 15-0041 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD8-FITC (53-6.7) | eBioscience | 11-0081 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| PBS57/mCD1d tetramer-APC | NIH Tetramer Core Facility | N/A | Obtained as a gift from the facility |
| anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597) | eBioscience | 25-5961 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4) | eBioscience | 47-3351 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11) | eBioscience | 25-0451 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| anti-Mouse IFN gamma-PE (XMG1.2) | eBioscience | 12-7311 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111 | Manufacturer recommends a certain test size; however this should be titrated before use. |
| Mouse IFN gamma ELISA kit | eBioscience | 88-7314 | Used for measuring the interferon gamma in the culture supernatant |
| 50 mL vented tubes for culture | Used for culturing the bacteria, any brand should be appropriate | ||
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | any brand should be appropriate | ||
| bacterial petri dishes | any brand should be appropriate | ||
| 2 ml cyrovials | any brand should be appropriate | ||
| UV spectrometer | any brand should be appropriate | ||
| safety engineered needles | any brand should be appropriate | ||
| C57BL6/J | Jackson laboratories | Stock#000664 | Order for arrival at 7 wks |
| Bleach | For decontamination | ||
| 70% Ethanol | For decontamination | ||
| Glass beads | any brand should be appropriate | ||
| Centrifuge | rotor, buckets, bucket covers. | ||
| Microcentrifuge | any brand should be appropriate | ||
| Sterile Glycerol | any brand should be appropriate | ||
| Pipette Tips | any brand should be appropriate | ||
| Pipette | any brand should be appropriate | ||
| Surgical instruments | any brand should be appropriate | ||
| 70 micron strainers | any brand should be appropriate | ||
| 3 ml syringe | any brand should be appropriate | ||
| Pipette gun | any brand should be appropriate | ||
| Filtration Units | any brand should be appropriate | ||
| Trypan Blue | Dilute 1 to 9 in ddH20, any brand should be appropriate | ||
| Hemocytometer | any brand should be appropriate | ||
| Round bottomed plates | any brand should be appropriate | ||
| FACs tubes | BD | ||
| BD LSR II | BD | Any flow cytometer could be used for acquisition that has an appropriate laser configuration and filter set to discriminate the fluorochormes | |
| Flowjo software | Treestar | Used for data analysis. Other types of data analysis software will also be appropriate | |
| Multichannel pipettor (0-300 µl) | Eppendorf | Used for washing cells and adding antibodies during flow cytometry staining | |
| Acetic Acid | Used for washing glass beads, any brand should be appropriate | ||
| Microbank Bacterial Preservation System | Pro-lab Diagnositics | Used as an alternative to glycerol stocks for long-term storage of bacteria |
Riferimenti
- Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4 (10), 812-823 (2004).
- Ranson, T., et al. Invariant V alpha 14+ NKT cells participate in the early response to enteric Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 175 (2), 1137-1144 (2005).
- Bancroft, G. J., Schreiber, R. D., Unanue, E. R. Natural immunity: a T-cell-independent pathway of macrophage activation, defined in the scid mouse. Immunol Rev. 124, 5-24 (1991).
- Soudja, S. M., et al. Memory-T-cell-derived interferon-gamma instructs potent innate cell activation for protective immunity. Immunity. 40 (6), 974-988 (2014).
- Schoenborn, J. R., Wilson, C. B. Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses. Adv Immunol. 96, 41-101 (2007).
- Filipe-Santos, O., et al. Inborn errors of IL-12/23- and IFN-gamma-mediated immunity: molecular, cellular, and clinical features. Semin Immunol. 18 (6), 347-361 (2006).
- Flynn, J. L., et al. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Cooper, A. M., et al. Disseminated tuberculosis in interferon gamma gene-disrupted mice. J Exp Med. 178 (6), 2243-2247 (1993).
- Dalton, D. K., et al. Multiple defects of immune cell function in mice with disrupted interferon-gamma genes. Science. 259 (5102), 1739-1742 (1993).
- Harty, J. T., Bevan, M. J. Specific immunity to Listeria monocytogenes in the absence of IFN gamma. Immunity. 3 (1), 109-117 (1995).
- Huang, S., et al. Immune response in mice that lack the interferon-gamma receptor. Science. 259 (5102), 1742-1745 (1993).
- Wang, Z. E., Reiner, S. L., Zheng, S., Dalton, D. K., Locksley, R. M. CD4+ effector cells default to the Th2 pathway in interferon gamma-deficient mice infected with Leishmania major. J Exp Med. 179 (4), 1367-1371 (1994).
- Hess, J., Ladel, C., Miko, D., Kaufmann, S. H. Salmonella typhimurium aroA- infection in gene-targeted immunodeficient mice: major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacterial clearance independent of intracellular location. J Immunol. 156 (9), 3321-3326 (1996).
- Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. The roles of IFN gamma in protection against tumor development and cancer immunoediting. Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2), 95-109 (2002).
- Hodge, D. L., et al. IFN-gamma AU-rich element removal promotes chronic IFN-gamma expression and autoimmunity in mice. J Autoimmun. 53, 33-45 (2014).
- Seery, J. P., Carroll, J. M., Cattell, V., Watt, F. M. Antinuclear autoantibodies and lupus nephritis in transgenic mice expressing interferon gamma in the epidermis. J Exp Med. 186 (9), 1451-1459 (1997).
- Peng, S. L., Moslehi, J., Craft, J. Roles of interferon-gamma and interleukin-4 in murine lupus. J Clin Invest. 99 (8), 1936-1946 (1997).
- Savinov, A. Y., Wong, F. S., Chervonsky, A. V. IFN-gamma affects homing of diabetogenic T cells. J Immunol. 167 (11), 6637-6643 (2001).
- Miller, C. H., Maher, S. G., Young, H. A. Clinical Use of Interferon-gamma. Ann N Y Acad Sci. 1182, 69-79 (2009).
- Paget, C., Chow, M. T., Duret, H., Mattarollo, S. R., Smyth, M. J. Role of gammadelta T cells in alpha-galactosylceramide-mediated immunity. J Immunol. 188 (8), 3928-3939 (2012).
- Leonard, J. P., et al. Effects of single-dose interleukin-12 exposure on interleukin-12-associated toxicity and interferon-gamma production. Blood. 90 (7), 2541-2548 (1997).
- Zenewicz, L. A., Shen, H. Innate and adaptive immune responses to Listeria monocytogenes: a short overview. Microbes Infect. 9 (10), 1208-1215 (2007).
- Viegas, N., et al. IFN-gamma production by CD27(+) NK cells exacerbates Listeria monocytogenes infection in mice by inhibiting granulocyte mobilization. Eur J Immunol. 43 (10), 2626-2637 (2013).
- Selvanantham, T., et al. Nod1 and Nod2 enhance TLR-mediated invariant NKT cell activation during bacterial infection. J Immunol. 191 (11), 5646-5654 (2013).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Unit 9B.2 Listeria monocytogenes: cultivation and laboratory maintenance, Chapter 31B. Curr Protoc Microbiol. , (2013).
- Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. ILAR J. 47 (4), 283-293 (2006).
- Obernier, J. A., Baldwin, R. L. Establishing an appropriate period of acclimatization following transportation of laboratory animals. ILAR J. 47 (4), 364-369 (2006).
- Zhang, M. A., Ahn, J. J., Zhao, F. L., Selvanantham, T., Mallevaey, T., Stock, N., Correa, L., Clark, R., Spaner, D., Dunn, S. E. Antagonizing peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) activity enhances Th1 immunity in male mice. J. Immunol. , (2015).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric estimation from incomplete observations. J Amer Stat Assoc. 53, 457-481 (1958).
- Brown, D. R., et al. Limited role of CD28-mediated signals in T helper subset differentiation. J Exp Med. 184 (3), 803-810 (1996).
- Czuprynski, C. J., Brown, J. F. The relative difference in anti-Listeria resistance of C57BL/6 and A/J mice is not eliminated by active immunization or by transfer of Listeria-immune T cells. Immunology. 58 (3), 437-443 (1986).
- Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes, Chapter 19. Curr Protoc Immunol. , (2001).
- Mekada, K., et al. Genetic differences among C57BL/6 substrains. Exp Anim. 58 (2), 141-149 (2009).
- Ivanov, I. I., et al. Specific microbiota direct the differentiation of IL-17-producing T-helper cells in the mucosa of the small intestine. Cell Host Microbe. 4 (4), 337-349 (2008).
- Bou Ghanem, N. E., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D’Orazio, S. E. Oral transmission of Listeria monocytogenes in mice via ingestion of contaminated food. J Vis Exp. (75), e50381 (2013).
- Lecuit, M., Dramsi, S., Gottardi, C., Fedor-Chaiken, M., Gumbiner, B., Cossart, P. A single amino acid in E-cadherin responsible for host specificity towards the human pathogen Listeria monocytogenes. Embo J. 18 (14), 3956-3963 (1999).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129 (5), 891-902 (2007).
- Brunt, L. M., Portnoy, D. A., Unanue, E. R. Presentation of Listeria monocytogenes to CD8+ T cells requires secretion of hemolysin and intracellular bacterial growth. J Immunol. 145 (11), 3540-3546 (1990).
- Muraille, E., et al. Distinct in vivo dendritic cell activation by live versus killed Listeria monocytogenes. Eur J Immunol. 35 (5), 1463-1471 (2005).
- Datta, S. K., et al. Vaccination with irradiated Listeria induces protective T cell immunity. Immunity. 25 (1), 143-152 (2006).
- Geginat, G., Schenk, S., Skoberne, M., Goebel, W., Hof, H. A novel approach of direct ex vivo epitope mapping identifies dominant and subdominant CD4 and CD8 T cell epitopes from Listeria monocytogenes. J Immunol. 166 (3), 1877-1884 (2001).
- Shen, H., et al. Recombinant Listeria monocytogenes as a live vaccine vehicle for the induction of protective anti-viral cell-mediated immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (9), 3987-3991 (1995).
- Foulds, K. E., et al. Cutting edge: CD4 and CD8 T cells are intrinsically different in their proliferative responses. J Immunol. 168 (4), 1528-1532 (2002).
