Multimodale Bildgebung und Spektroskopie Faserbündelmikroendoskopie Plattform für Nicht-invasive,<em> In Vivo</em> Gewebeanalyse
Summary
The assembly and use of a multimodal microendoscope is described which can co-register superficial tissue image data with tissue physiological parameters including hemoglobin concentration, melanin concentration, and oxygen saturation. This technique can be useful for evaluating tissue structure and perfusion, and can be optimized for individual needs of the investigator.
Abstract
Recent Faserbündelmikroendoskopie Techniken ermöglichen nicht-invasive Analyse von in vivo Gewebe entweder Bildgebungstechniken oder eine Kombination von Spektroskopie – Techniken. Die Kombination von Techniken Bildgebung und Spektroskopie in einer einzigen optischen Sonde kann eine vollständigere Analyse von Gewebe Gesundheit. In diesem Artikel werden zwei unterschiedliche Modalitäten kombiniert, hochauflösende Fluoreszenzmikroendoskopie Bildgebung und diffuse Reflexionsspektroskopie, in einem einzigen optischen Sonde. Hochauflösende Fluoreszenzmikroendoskopie Bildgebung ist eine Technik verwendet, um apikale Gewebe-Mikroarchitektur visualisieren und zwar meist eine qualitative Technik hat effektive Echtzeit-Differenzierung zwischen neoplastischen und nicht-neoplastischen Gewebe nachgewiesen. Diffuse Reflexionsspektroskopie ist eine Technik, die Gewebe physiologischen Parametern, einschließlich der lokalen Hämoglobinkonzentration extrahieren kann, Melaninkonzentration und die Sauerstoffsättigung. Dieser Artikel beschreibt die Spezifikationen required die faseroptische Sonde zu konstruieren, wie die Instrumentierung zu bauen, und zeigt dann die Technik auf in vivo menschlichen Haut. Diese Arbeit zeigte, dass Gewebe-Mikroarchitektur, die speziell apikal Hautkeratinozyten kann mit den damit verbundenen physiologischen Parametern zusammen registriert werden. Die Instrumentierung und Faserbündel-Sonde hier dargestellt kann in einer Vielzahl von Organsystemen für den Einsatz entweder als ein Handheld oder endoskopisch-kompatiblen Gerät optimiert werden. Weitere klinische Forschung ist notwendig, um die Lebensfähigkeit dieser Technik für verschiedene epitheliale Krankheitszustände zu testen.
Introduction
Faserbündel Mikroendoskopie Techniken analysieren typischerweise in vivo Gewebe entweder mit bildgebenden Verfahren oder eine Kombination von Spektroskopie – Techniken. 1-3 Eine solche Abbildungstechnik, hochauflösende Fluoreszenzmikroendoskopie, können Bild apikal Gewebe – Mikroarchitektur mit subzellulärer Auflösung in einem kleinen , mikroskaligen Feld-of-view, ein aktuelles Kontrastmittel wie Proflavinkonzentration, Fluorescein oder Pyranin Tinte. 1,3-11 Diese Bildgebungsmodalität klinische Leistung hat gezeigt , viel versprechende in qualitativ differenzier kranken und gesunden Epithelgewebe in Echtzeit unter Verwendung von mit niedrigen Gelegentlich inter~~POS=TRUNC Variabilität. 8, werden die Ermittler hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie Daten verwenden , um quantitative Merkmale wie Zell- und Kerngröße oder Drüse Bereich extrahieren, aber dies bleibt ein in erster Linie qualitative Technik gezielt in Richtung Gewebemorphologie zu visualisieren. 1,3,8- 10 Andererseits seits~~POS=HEADCOMP Spektroskopietechniken, wie beispielsals diffuse Reflexionsspektroskopie, sind auf die Bereitstellung funktioneller Gewebeinformationen gezielt und haben in quantitativ zu identifizieren Krebsläsionen in mehreren Organen vielversprechende klinische Leistungsfähigkeit gezeigt. 2,12-15
Daher besteht ein Bedarf für eine Vorrichtung, beide Arten von Modalitäten möglicherweise weiter zu reduzieren inter-observer Variabilität enthalten, zu erhalten Echtzeit-Visualisierung von Gewebe-Mikroarchitektur und stellen eine vollständigere Analyse der Gewebegesundheit. Um dieses Ziel zu erreichen, ein multimodales sondenbasierte Instrument wurde konstruiert , das zwei Modalitäten in einem einzigen faseroptischen Sonde kombiniert. Hochauflösende Fluoreszenzmikroendoskopie und Unter diffuser Reflexionsspektroskopie 11 Dieses Verfahren co-registers qualitative Bilder mit hoher Auflösung von apical Gewebemorphologie (strukturellen Eigenschaften) mit quantitativen spektrale Information (funktionelle Eigenschaften) aus zwei verschiedenen Gewebetiefen, einschließlich der lokalen Hämoglobinkonzentration ([Hb]), Melanin – Konzentration ([Mel]) und Sauerstoffsättigung (SaO 2). 11,12,16 Diese spezifische Unter diffusen Reflexionsspektroskopie Modalität verwendet zwei Quellen-Detektor – Trennungen (SDSs) zwei einzigartige Gewebetiefen zur Probe zur Verfügung zu stellen ein umfassenderes Bild der Gewebegesundheit durch an die Basalmembran und das darunter liegende Gewebe Stroma Abtasten nach unten. 11
Die Faser-Sonde besteht aus einem zentralen 1 mm Durchmesser Bildfaser mit ca. 50.000 4,5 um Durchmesser Faserelementen, einem Manteldurchmesser von 1,1 mm und einer Gesamtbeschichtungsdurchmesser von 1,2 mm. Die Bildfaser wird von fünf 200 & mgr; m Durchmesser Fasern mit Manteldurchmesser von 220 & mgr; m umgeben. Jede 200 & mgr; m Multimode-Faser ist ein Mitte-zu-Zentrum Abstand von 864 & mgr; m entfernt von der Mitte der Bildfaser. Jedes der 200 & mgr; m Multimode-Fasern sind 25 ° auseinander. Mit dem am weitesten links stehende 200 & mgr; m Multimode-Faser als "Quelle" Faser, und die zusätzliche three 200 & mgr; m Multimode-Fasern als die "Sammlung" Fasern, schafft diese Geometrie notwendigerweise drei Mitte-zu-Mitte SDSs von 374 & mgr; m, 730 & mgr; m, 1051 & mgr; m und 1323 & mgr; m. Die Faserspitzen werden in einem zylindrischen Metallgehäuse eingeschlossen, dass die Abstände zwischen den Fasern konstant hält. Der Durchmesser des zylinderförmigen Metallgehäuses ist 3 mm. Das distale Ende (in Richtung der faseroptischen Sondenspitze) der faseroptischen Sonde 2 Meter lang. Die Sonde trennt dann in den sechs jeweiligen einzelnen Fasern am proximalen Ende ( in Richtung der Instrumentierungs) , die zusätzlich 2 Meter lang ist, für eine Gesamtlänge von 4 Fuß. 1 zeigt eine Darstellung des faseroptischen Sonde.
Abb . 1: faseroptische Sonde Design Die faseroptische Sonde besteht aus einem 1 mm Durchmesser Bildfaser und vier 200 um Multimode – Fasern. DiesAbbildung zeigt Darstellungen von (a) die Metallabschlusskappe , die die Geometrie der Fasern an der Sondenspitze beschränkt SDSs von 374, 730 und 1051 & mgr; m in Bezug auf die am weitesten links stehende 200 & mgr; m Multimode – Faser (Skala bar ≈ 1 mm) zu erhalten, (b) die Fasern innerhalb der Metallkappe eingeschränkt zu werden, um die Faserkerne zeigt, Fasermantel und Faserbeschichtung (Skala bar ≈ 1 mm), (c) die Schutz Polyamid Ummantelung um die Fasern (Skala bar ≈ 1 mm), (d ) die fertige distale Spitze der Sonde, mit dem Metall Fingergriff und einzelne schwarze Kabel alle Fasern (Skala bar ≈ 4 mm), und (e) ein Bild von der distalen Spitze der Sonde (Skala bar ≈ 4 mm) enthält. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Diese multimodalen Instrumentierung und die damit verbundenen technique ist die erste Kombination dieser Modalitäten innerhalb einer einzigen Sonde, obwohl andere kombinierte strukturelle / funktionelle Techniken tun, dass verschiedene Modalitäten kombinieren existieren. Zum Beispiel verbindet hyperspektrale Bildweitfeld – Bildgebung mit quantitativen Hämoglobin und Melanin Eigenschaften, 17,18 und andere Techniken entwickelt worden , die die optische Kohärenztomographie kombinieren (OCT) mit Analyse von Gewebeproteinexpression, 19 ein paar zu nennen. Dieser Artikel berichtet über eine kompakte und einfach zu implementierende Instrumentierungs Einrichtung, die eine allgemeine faseroptische Sonde verwendet, die für verschiedene Zwecke, einschließlich endoskopischen Einsatz im unteren Gastrointestinaltrakt und der Speiseröhre oder als Handsonde zur Verwendung in der Mundhöhle optimiert werden kann, und Außenhaut Platzierung. 11,20
Die Hardware für diese Besetzung erfordert sowohl individuelle Datenerfassung und Nachbearbeitung Code diffusen Reflexionsspektren zu erfassen und extrahieren Sie dann die resultierende volumE-gemittelte Gewebe physiologische Parameter einschließlich [Hb], [Mel] und SaO 2. Die benutzerdefinierte Datenerfassungscode wurde die gleichzeitige Erfassung von einer Kamera (für hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie) und ein Spektrometer (für diffuse Reflexionsspektroskopie) zu ermöglichen, errichtet. Treiber sind von den Websites der Hersteller oft zur Verfügung Integration mit einer Vielzahl von Programmiersprachen zu ermöglichen. Die benutzerdefinierte Post-Processing – Code importiert a priori – Absorptionswerte von in vivo [Hb] und [Mel] 21 und verwendet dann eine zuvor nicht – linearen entwickelte Optimierungsanpassungsprozess, der eine angepasste Kurve der Spektren erzeugt. 22 Die angepasste Kurve durch Minimierung der gebaut χ 2 -Wert zwischen sich und dem Rohspektren und die Gewebe physiologischen Parameter zu bestimmen ([Hb], [Mel] und SaO 2) aus der angepassten Kurve und mit dem niedrigsten χ 2 -Wert. 22 der Code kann geändert werden , umfassenAbsorption von anderen Chromophoren als auch, wie die exogenen Pyranin Tinte hier verwendet wird, so dass Ziel sind physiologische Parameter nicht beeinflusst.
Physiologische Indikatoren der Gewebegesundheit, wie [Hb], [Mel] und SaO 2, können als Berichte von Tumor Ansprechen auf die Therapie oder als Indikatoren für die lokale Vaskularisierung und Angiogenese verwendet werden. 14,23 Inklusive einer hochauflösenden Fluoreszenzmikroendoskopie Modalität hilft Sonde Plazierungsführung und ist ein interner vollständigeres Bild der Beziehung zwischen Epithelgewebe Struktur und Funktion. In diesem Artikel, den Bau und die Anwendung des multimodalen Mikroendoskop beschrieben. 11
Protocol
Representative Results
Discussion
Die multimodalen hochauflösende Bildgebung und Unter diffusen Reflexionsspektroskopie Faserbündel- Mikroendoskop hier berichtet können von den Forschern für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich endoskopischen oder Hand Verwendung für die menschliche oder tierische Studien optimiert und verwendet werden. Es stellt somit eine flexible Methode zur di – vivo – apikal Gewebe – Mikroarchitektur neben Messungen der Hämoglobinkonzentration, Melaninkonzentration und Gewebesauerstoffsättig…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This material is based on work supported by the National Institutes of Health (1R03-CA182052, 1R15-CA202662), the National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (G.G., DGE-1450079), the Arkansas Biosciences Institute, and the University of Arkansas Doctoral Academy Fellowship. Any opinions, findings, and conclusions or recommendations expressed in this material are those of the authors and do not necessarily reflect the views of the acknowledged funding agencies.
Materials
| 30 mm Cage Cube with Dichroic Filter Mount | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Dichroic Mirror (Beam Splitter) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Cage Assembly Rod, 1.5", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 3.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Cage Assembly Rod, 2.0", 4-Pack | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 | |
| SM1-Threaded 30 mm Cage Plate | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| SM1 Series Stress-Free Retaining Ring | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Lens Tube, 1.00" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1" UV Enhanced Aluminum Mirror | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Olympus Plan Achromatic Objective | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Translating Lens Mount | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Fiber Adapter Plate with SM1 Thread | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Lens Tube, 0.50" Thread Depth | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| 440/40 Bandpass Filter (Excitation) | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 Bandpass Filter (Emission) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Quick Set Epoxy | Loctite | 1395391 | |
| 455 nm LED Light Housing Kit – 3-Watt | LED Supply | ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Achromatic Doublet, f=50mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 USB Monochrome Camera | Point Grey, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0.5" Post Holder, L = 1.5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0.5" Optical Post, L = 4.0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| Mounting Base, 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| Long Lifetime Tungsten-Halogen Light Source (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20X Olympus Plan Objective | Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Arm Adaptor | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Motor Housing | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Stepper Motor – 400 steps/revolution | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Multiple suppliers |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Custom-Built Aluminum Optical Fiber Switch Face-Plate | N/A | N/A | Custom designed and built |
| Arduino Uno – R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Multiple suppliers |
| Electronic Breadboard – Self-Adhesive | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Multiple suppliers |
| EasyDriver – Stepper Motor Driver | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| 12V, 229 mA Power Supply | Phihong | PSM03A | Multiple suppliers |
| Enhanced Sensitivity USB Spectrometer (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µm, 0.22 NA, SMA-SMA Fiber Patch Cable | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Custom-Built Fiber-Optic Probe | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standard Yellow Highlighter | Sharpie | 25005 | Multiple suppliers, proflavine or fluorescein can be substituted |
Riferimenti
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