In vivo genoverføring til Schwann celler i gnagere isjiasnerven ved Electroporation

Summary

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Abstract

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

Introduction

The rapid transmission of sensory and motor information in the peripheral nervous system is permitted by the myelin sheath, which is formed by myelinating Schwann cells (SCs)¹. Insulation of axons by the myelin sheath enables saltatory conduction, which increases the speed of nerve impulses. In disorders in which the development or maintenance of the myelin sheath is impaired, nerve conduction speed is reduced. This results in neuropathy involving motor and sensory dysfunction. Although there are many studies on the molecular mechanisms of myelination and demyelination in the peripheral nervous system, the roles of the numerous proteins involved in these processes remain unclear.

To study the molecular mechanisms of SC myelination/demyelination in vivo, genetic approaches have been used to modify gene expression in animals. A powerful approach is the use of knockout/knockin or transgenic animals. However, the generation of these animals is expensive and time consuming. For SC-specific gene manipulation, crossing floxed strains with Cre mice or other conditional gene expression methods are necessary. This again is laborious and time intensive. In recent years, a cutting-edge genetic technology, the CRISPR-Cas9 system, has made the generation of genetically modified mice much quicker (about 4 weeks)^2,3, but this method is hindered by target sequence limitations, and suffers from off-target effects. As an alternative method, viral vector-mediated gene transfer is a faster and easier method of achieving gene transfer into SCs in vivo^4-6. Indeed, the generation of viral vectors is less expensive, and takes a shorter time (within a few weeks), and gene manipulation of SCs can be achieved by simply injecting engineered viral vectors, such as adenoviral vectors, adeno-associated viral (AAV) vectors, and lentiviral vectors, into the sciatic nerve. Because these viral vectors have different characteristics, users have to choose the one best suited for their purpose. Adenoviral vectors infect axons and SCs in both young and mature sciatic nerves. In particular, adenoviral vectors have higher selectively for non-myelinating SCs than myelinating SCs. Adenoviruses can cause immune responses, and accordingly, immunodeficient strains should be used⁵. AAV vectors are currently the most widely used viral vectors, and allow in vivo gene transfer with lower toxicity⁷. AAV can transduce both axons and SCs by direct injection into the nerve fibers^8,9. However, AAV-mediated protein expression usually requires 3 weeks or longer to reach maximum levels^7,9. Therefore, it is difficult to analyze myelination, which actively progresses during the two week postnatal period. Lentiviral vectors have higher selectively for myelinating SCs than non-myelinating SCs, and do not have toxic effects on sciatic nerves. However, lentiviral vectors do not infect SCs in more mature nerves⁵, and therefore are unsuitable for analyzing events such as the demyelination process.

Electroporation is another faster and easier approach to achieve in vivo gene transfer. It has been reported that in vivo transfection of SCs can be achieved when electroporation is applied to transected rat sciatic nerves¹⁰. However, because this method requires nerve transection for gene delivery, the application is limited to the analysis of the damaged nerves. Here, we describe an alternative method that allows the delivery of transgenes into myelinating SCs in intact rat sciatic nerves using electroporation¹¹. This method requires plasmid construction, which can usually be completed within a week. Then, by simply delivering electric pulses to the site on the sciatic nerve where the plasmid DNA was injected, highly selective transfection of myelinating SCs can be achieved in neonatal as well as in more mature animals. By electroporating multiple plasmids, simultaneous expression of a variety of genes can be easily achieved. The ability to simultaneous express multiple molecules, such as signaling proteins, short-hairpin RNAs (shRNAs) and functional probes, is crucial for investigating complex processes such as myelination and demyelination. The novel in vivo electroporation method described in this paper will be a powerful tool, allowing researchers to analyze the function of a multitude of molecules and their interactions in myelinating SCs.

Protocol

Bruken av rotter for forskning var i samsvar med retningslinjer fastsatt av Animal Welfare Committee of The University of Tokyo. 1.Preparation av plasmid-DNA Generer DNA-plasmider for in vivo elektroporering ved subkloning av cDNA eller shRNA-sekvensen inn i et plasmid for ekspresjon i pattedyrceller 12. Bruk en cytomegalovirus øyeblikkelig tidlig enhancer og kylling β-aktin promoter fusjon (CAG) promoter-drevet plasmid 13 fordi det gir sterk og stabil uttrykk. For uttrykk for shRNAs under kontroll av en CAG promoter, bruk en mir30 basert shRNA kassett system for subkloning av shRNA 14. Rense plasmid-DNA med et maksi-prep kit ifølge produsentens instruksjoner, og resuspender DNA med HEPES-bufret saltløsning (140 mM NaCl, 0,75 mM Na HPO 2 til 4, 25 mM HEPES; pH 7,40). Juster konsentrasjonen av DNA til ≥4 ug / ul. <li> Klargjør plasmid-DNA-oppløsningen til en konsentrasjon på 4 ug / ul, og legge til en minimal mengde av fast grønt fargestoff (sluttkonsentrasjon 0,01%) for å merke injeksjonsstedet. Når samtidig elektroporering av flere plasmider er nødvendig, justere den totale konsentrasjon av plasmid DNA løsningen på 4 ug / ul. Merk: Den optimale sammensetning av plasmid-DNA bør bestemmes i henhold til transfeksjonseffektiviteten av hvert plasmid. 2. Sterilisering av kirurgiske instrumenter og Saline Autoklav for kirurgiske instrumenter og 0,9% NaCl-oppløsning. 3. Utarbeidelse av Glass Mikropipette Trekk glass pipetter ved hjelp av en pipette avtrekker. Kutte spissen av pipetten til en diameter på 30-50 um. Bruk følgende parametre: Varme, 600; Velocity, 50; Time, 75. 4. Animal Surgery, Injection DNA og Electroporation Merk: En overUt fra dette trinnet er beskrevet i figur 1. Selv om fremgangsmåten for rotteunger er beskrevet her, idet fremgangsmåten er også anvendelig til mer modne dyr ved hjelp av den samme prosedyre. Bedøve rotte med isofluran i induksjonsfeltet helt til dyret blir immobile ved å justere oksygenstrømmen til 0,4 l / min, og isofluran konsentrasjonen til 4% (vol / vol). Utfør tå knipe for å bekrefte riktig anesthetization. Sett rotte på forvarmet varmere under en kikkert mikroskop, og opprettholde anestesi ved kontinuerlig administrasjon isofluran gjennom ansiktsmaske. Juster oksygenstrømmen til 0,2 l / min, og isofluran konsentrasjon til 2% (vol / vol). Bruk øyedråper for å hindre tørrhet i øyne dersom øynene på dyret er åpne. Fest bena med kirurgisk tape. Rengjør huden på baksiden av låret med povidon-jod, og gjør et snitt med en skalpell. Merk: Shave kirurgiske områder hvis de kirurgiske områder er dekket med hluft. Expose isjiasnerven ved å lage en åpning mellom quadriceps femoris muskler og biceps femoris muskler med synåler. Fukt nerve med 0,9% NaCl-oppløsning. Absorbere overflødig vann med lofri papir. Sett bunnen av en glass mikropipette på det fleksible røret, og fylle det tilstrekkelig mengde av DNA-oppløsningen (i det minste én mikroliter) til mikropipette ved forsiktig å aspirere. Løft eksponert nerve ved å forsiktig dra den distale siden av nerve ved hjelp av en nål. Merk: Ikke bruk spenning til nerve å minimere mekanisk stress. Sett glasset mikropipette inn i det distale området på nerve, og injisere DNA-oppløsningen ved å påføre trykk (dvs. ved å blåse inn i den åpne ende av det fleksible rør). Injiser DNA-oppløsning inntil nerve vises grønn (1 ul maksimum). Fordi hyppig innsetting av mikropipette kan skade nerve, må du ikke sette mikropipette mer enn to ganger. Plasser en TWEezer-type platina elektrode ca 1-2 mm fra nerven. Fylle gapet mellom elektroden og det nerve med 0,9% NaCl-oppløsning. Merk: Ikke hold nerve med elektroden for å unngå mekanisk stress på nerve. Påfør elektriske pulser til injeksjonsstedet ved hjelp av en electroporator med elektroden. Etter den første pulsen sett, snu elektroden og bruke en annen puls sett. Bruk følgende parametere: spenning, 50 V; puls varighet, 5 ms; puls intervall, 100 ms; puls nummer, 4 ganger. Rengjør electroporation stedet med 0,9% NaCl-løsning. Gjenta trinn 04.04 til 04.11 på den kontralaterale hoftenervene. 5. Post-electroporation Lukk snittene med cyanoakrylatlim. Etter tørking av lim, rense såret med povidon-jod. Slipp valpen fra ansiktsmaske. Varm valpen på en varmere i hvert fall for en time for å tillate det å fullt igjen fra anestesi. Do ikke la valpen uten tilsyn før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet. Etter utvinning fra anestesi, tilbake valpen til moren rotte. Ikke gå tilbake valpen til den er helt restituert. 6. Post-kirurgi Hus på rotteunger i buret inntil gjennomføre forsøkene 11 (se eksempler i figur 3). Administrere karprofen (5 mg / kg, ip), et ikke-steroid anti-inflammatorisk legemiddel, eller buprenorfin (0,1 mg / kg, sc), et opioid smertestillende middel, om nødvendig. Merk: Hvis rotta valpen ikke vokser godt eller betennelse er observert rundt operasjonen området, utelukker dyret fra forsøkene.

Representative Results

Et eksempel på en hoftenervene transfektert med rødt fluorescerende protein (RFP) -expressing plasmid er vist i figur 2A. Celler som viser bipolar morfologi, karakteristisk for SC'er ble tynt transfektert med RFP. Ingen RFP fluorescens ble påvist i aksoner. Vi finner vanligvis ~ 100 transfekterte SC'er i hver nerve. Dette transfeksjonseffektivitet synes lik den in vivo SC infeksjon effektivitet ved hjelp av lentivirale vektorer 4. Immunfarging forsøk viste at de fleste (~ 96%) RFP-positive celler ved P7 ko-merket for S100, en SC markør (figur 2B), og 91% av RFP-positive celler ved P14 co-merket for MBP, et myelinerende SC markør (figur 2C), hvilket antyder at genoverføring ved elektroporering er sterkt selektiv for myelinerende SC'er. Innføring av flere gener i SC'er <em> in vivo vil være svært nyttig for å undersøke mekanismene for myelinisering / demyelinisering. En stor fordel av in vivo elektroporering fremgangsmåte som er beskrevet her er evnen til å overføre flere gener med en enkel prosedyre. Figur 2D viser et representativt bilde av en hoftenervene transfektert med en blanding av GFP og RFP-uttrykkende plasmider ved hjelp av in vivo elektroporering. Omtrent 97% av SC'er ble GFP og RFP dobbel positiv, noe som tyder på at svært effektiv levering av multiple gener kan oppnås ved ganske enkelt å electroporating blandinger av flere plasmider. I gnagere, myelination starter rundt fødselen, dramatisk øke i løpet av de to første ukene etter fødselen, og deretter gradvis avtar. Således, ved genetisk manipulering SC'er løpet av disse utviklingstidsvinduene, mekanismene bak disse forskjellige stadier av myelination kan avklares. Lentiviral vektorer er et godt verktøy for ennalyzing myelination, særlig når de har minimal giftighet, men lentiviruses bare infisere neonatal sciatic nervene 5,6. Til sammenligning virker elektroporasjon-mediert genoverføring godt når transfeksjon utføres på P3 (figur 2E, øverst) eller P14 (figur 2E, nederst). Programmene i romanen in vivo elektroporeringsmetoden er beskrevet her. Figur 3A viser lette mikroskopiske bilder av GFP-uttrykke myelinerende SC'er på ulike utviklingsstadier (P7, P14, P21 og P31). Ved lys mikroskopisk analyse, endringer i morfologiske parametere, slik som lengde og diameter, kan vurderes. Merk at disse parameterne har samme verdier sammenlignet med inntakt rotte perifere nerver 15,16, noe som tyder på at de elektroporerte nervene utvikle seg uten signifikante skadelige effekter. Figur 3B viser et elektronmikroskopbilde av LacZ-EXPREssing myelinerende SC'er. I dette tilfelle ble LacZ benyttet som et uttrykk markør. β-galaktosidase-farging ved hjelp av Bluo-gal, en etanol-uoppløselig substrat, muliggjør analyse av myelin struktur av transfekterte SC'er ved elektronmikroskopi 11,17. I disse eksperimentene kan rollen som signalmolekyler undersøkes ved stanse eller forsterke deres ekspresjon, for derved å tillate analyse av tap-av-funksjon eller få-av-funksjon effekter. I tillegg til analyse av faste vev, kan in vivo elektroporering-mediert genoverføring kan også anvendes til å leve bildebehandling eksperimenter. For eksempel viser figur 3C en myelinerende SC ko-uttrykker G-GECO1.1 18, en grønn fluorescerende cytosoliske Ca 2+ indikator, og R-GECO1mt 19, et rødt fluorescerende mitokondrielle Ca 2+ indikator. Ved å uttrykke disse indikatorene, identifiserte vi en signalveien som styrer cytosoliske og mitokondrielle Ca 2+ konsentrasjoner i myelinerende SC'er . Således kan foreliggende fremgangsmåte brukes til å undersøke en rekke signaleringsmekanismer, særlig ved genetisk kodede fluorescerende prober er tilgjengelige for å detektere signalene av interesse. Fig. 1: Skjematisk av i n vivo elektroporeringsmetoden Først isjiasnerven hos en bedøvet rotte utsettes for. For det andre, blir plasmid-DNA injiseres i isjiasnerven. Tredje, elektriske pulser leveres til injeksjonsstedet gjennom tang-formet elektroden. Til slutt blir såret lukkes med lim. Denne prosedyren kan gjentas på motsatt nerve. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. "> Figur 2: Representative Resultater på Transfekterte sciatic nervene (A) En representant bilde av en transfektert isjiasnerven.. Den nerve ble transfektert med RFP-uttrykke plasmid på P3, og fast på P7. (B) Et representativt bilde av en RFP-transfekterte celle ved P7 viser colocalization med S100, en SC markør. (C) Et representativt bilde av en RFP-transfekterte isjiasnerven ved P14 viser colocalization med MBP, et myelinerende SC markør. (D) En representant bilde av en hoftenervene transfektert med GFP og RFP-uttrykke plasmider. Transfekterte SC'er samtidig uttrykt GFP og RFP. (E) Et bilde av myelinerende SC'er på P31 transfekterte på P3, når myelination begynner (øverst), og et bilde av myelinerende SC'er på P31 transfektert ved P14, når de fleste store axoner bli myelinated (nederst), noe som tyder på at transfection av myelinerende SC'er kan oppnås ikke bare i neonatal nerver, men også i mer modne nerver. Skala barer = 200 um (A); 50 mikrometer (BE). Dette tallet ble endret fra forrige publisering 11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Anvendelse av in vivo Elektroporering (A) En lys mikroskopisk analyse av utviklingen av myelinerende SC'er.. Sciatic nervene ble electroporated med GFP-uttrykke plasmid på P3, og ble løst på ulike utviklingsstadier (P7, P14, P21 og P31). Representative bilder av GFP-positive SC'er vises til venstre. Den gjennomsnittlige lengde og diameter er oppsummert som gjennomsnitt ± SEM (n = 30-47 fra 3 nerver) til høyre. Lengden og diameteren myelinerende SpA øker som utvikling fortsetter. (B) En elektronmikroskopbilde av en hoftenervene transfektert med et plasmid som koder for LacZ. En transfektert SC (hvit stjerne, venstre) ble fint merket med utfellinger av β-galaktosidase reaksjonsprodukt. (C) Et bilde av en SC kotransfektert med G-GECO1.1, en ​​grønn fluorescerende cytosoliske Ca 2+ indikator, og R-GECO1mt, et rødt fluorescerende mitokondriell Ca 2+ indikator. Regionene innenfor de hvite stiplede rektangler vises forstørret i panelene på høyre side. Skala barer = 50 um (A og C); 1 pm (b). Dette tallet ble endret fra forrige publisering 11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

In this paper, we describe a simple and efficient method that allows in vivo gene transfer to myelinating SCs in the rat sciatic nerve using electroporation. This method allows highly selective gene expression in myelinating SCs by simply applying electric pulses to the plasmid DNA-injected sciatic nerve. Because the molecular mechanisms of myelination and demyelination in the peripheral nervous system remain unclear, the present in vivo electroporation method will be a powerful tool to clarify the roles of multiple genes of interest in living animals.

A critical requirement of this method is to keep damage to the nerve during surgery to a minimal level. Should surgical damage cause excessive inflammation, the sciatic nerve may degenerate. To avoid this, one must conduct surgery with extreme care, so as to not damage the blood vessels around the nerve. Mechanical stress to the nerve during the surgery can also be a cause of nerve damage. To minimize mechanical stress, lifting the exposed nerve should be done as gently as possible, and the tweezer-type electrode should be placed close to the nerve without contact. Furthermore, electrical pulses that are too strong can cause undesirable large leg movement, which leads to mechanical stress, or can burn the nerve. If significant damages are observed in the nerves, we recommend reducing the electrical pulse intensities or placing the electrode further away from the nerve.

In our present protocol, CAG promoter-driven plasmids were used as expression vectors. CAG promoter-driven plasmids allow high levels of gene expression in myelinating SCs in vivo. We also have tried a CMV promoter, another widely used universal promoter for mammalian gene expression, but expression of the gene product was very weak. This is consistent with previous results, in which electroporation-mediated transfection was conducted in the embryonic brain²⁰. Therefore, we recommend using CAG promoter-driven plasmids for the in vivo electroporation method.

Because axonal signaling is a key factor in myelination/demyelination²¹, gene modification in neurons is also important. However, delivery of transgenes using our in vivo electroporation method is limited to SCs. It has been reported that gene delivery into sciatic nerve axons can be achieved when in vivo electroporation is applied to dorsal root ganglion (DRG) neurons in adult rats²². This suggests that delivery of plasmid DNA to the cell body is likely to be critical for in vivo transfection of peripheral axons. Thus, to examine the involvement of axonal molecules in myelination/demyelination, researchers should use neuron-specific genetic methods such as genetically modified animals, neuron-specific viral vectors, or in vivo electroporation to DRG neurons.

Compared with current methods, such as the generation of genetically modified animal lines²³ and delivery of transgenes by viral vectors^4-6, gene modification of SCs by in vivo electroporation is simpler. This method only requires several days for plasmid DNA construction and one day for electroporation surgery. Plasmid DNA construction does not require a biohazard room that is usually essential for viral vector handling. In addition, one of the advantages of the electroporation method is the capacity for simultaneous expression of multiple gene products using a simple protocol. Our novel technique will be useful for analyzing the interaction of a variety of signaling molecules involved in myelination and demyelination. In particular, by permitting the cotransfection of a number of different intracellular fluorescent probes, our method should be a powerful tool for investigating intracellular signaling dynamics in SCs using live imaging experiments.

Materials

Genopure Plasmid Maxi Kit	Roche	03 143 422 001	Plasmid DNA purification kit
Fast Green CFC	WAKO	069-00032	Dye for DNA injection
GC 150T-10	HARVARD APPARATUS	30-0062	Glass capillary
Suction tubing	Drummond	05-2000-00	Suction tubing for micro injection
MODEL P-97	SUTTER INSTRUMENT CO.		Micropipette puller
CUY21 Single Cell	BEX	Electroporator CUY21 Single Cell	Pulse generator
Electric warmer	KODEN	CAH-6A	Warmer during the surgery
Isofluolane	Mylan	1119701G1076	Anesthetic