Bir Ayarlanabilir Nanopore aracılığıyla Nanopartikül Translokasyon Hızları aracılığıyla Zeta Potansiyeli Belirlenmesi: Bir Örnek olarak DNA modifiye Parçacıklar kullanma

Summary

Burada tek tek nanopartiküllerin zeta potansiyelini belirlemek için kullanılabilir partikül translokasyon hızlarının ölçümü ile nanopartiküller yüzey kimyası karakterize etmek için bir dirençli darbe algılama tekniği entegre bir poliüretan ayarlanabilir Nanopore kullanımı.

Abstract

Dirençli Darbe Sensörleri (RPS) olarak topluca bilinen nanopore teknolojileri, tespit ölçmek ve proteinler, moleküller ve nanopartiküller karakterize etmek için kullanılmaktadır. Ayarlanabilir direnç darbe algılama (TRPS) gerçek zamanlı olarak değişmiş olabilir ayarlanabilir bir gözenek içeren RPS için nispeten yeni bir uyarlamasıdır. Bunlar DNA konsantrasyonu ve yapısının bir fonksiyonu olarak ayarlanabilir bir gözenek membran çapraz olarak burada, DNA-modifiye edilmiş nanopartiküller translokasyon kez izlemek için TRPS kullanımı (örneğin, tek sarmallı iki-şeritli DNA'ya).

TRPS uygulanan bir elektrik alanı üzerine bir sabit iyon akımı oluşturan elastomerik bir gözenekli membran ile ayrılmış, iki Ag / AgCI elektrot dayanır. Çeşitli optik tabanlı parçacık karakterizasyonu teknolojilerinin aksine, TRPS modelli örnekleri kolaylıkla analiz edilmesi için izin, bir örnek nüfusu arasında bireysel parçacıklar karakterize edilebilir. Burada, zeta potansiyel ölçümleri göstermektedirBilinen standartların parçacık translokasyon hızlar aracılığı ile ve böylece bu analitlerin zeta potansiyelini ölçmek sonuçlanan analit translokasyon kez örneklemek için bu geçerlidir.

Yanı sıra ortalama zeta potansiyeli değerleri elde olarak, numune, tüm Örneğin, örnek nüfustan vasıtası ile verilen bir örnek üzerinde daha ayrıntılı bilgi gösteren bir parçacık tarafından tanecikli perspektif kullanılarak ölçülür. Böyle ki, bu yöntem hem tıbbi ve çevresel alanlar için algılama uygulamaları içinde potansiyelini göstermektedir.

Introduction

Fonksiyonlu nanopartiküller, tıbbi ve çevresel alanlarda hem biyosensörler olarak giderek daha popüler hale gelmektedir. Kabiliyeti, örneğin, hedeflenen ilaç verme sistemleri ¹ ve izleme, DNA-protein etkileşimleri ^2-4 için yararlı olduğunu kanıtlamaktadır, DNA ile, bir nanopartikül yüzey kimyasını değiştirmek için. Giderek yaygınlaşan bir nanoparçacık mülkiyet biyo-deneylerde kullanılan ve terapötik teslim süperparamanyetizma ^5'tir ediliyor. Süpermanyetik parçacıklar (SPSS) belirlenmesi ve karmaşık karışımlarından özel analitleri çıkarılmasında son derece yararlıdır ve tek bir mıknatıs basit kullanımı ile bunu yapabilirsiniz. Bir kez çıkarıldı analit-bağlanmış parçacıklar, özelliği ve amaca uygun olarak analiz edilebilir.

Nanopartiküllerin saptanması ve tanımlanması için kullanılan önceki metotlarda, aksi foton korelasyon spektroskopisi olarak bilinen bu dinamik ışık saçılımı (DLS) gibi optik teknikler bulunmaktadır. Bir hi rağmengh throughput tekniği, DLS bir ortalama bazlı teknik olmak ve uzman bir yazılım ilavesi olmadan multimodal numunelerin analiz ederken sınırlıdır, büyük partiküller ^6,7 tamamen fark edilmeden küçük parçacıkların bazı bırakarak, çok daha baskın bir sinyal üretecek. Parçacık-by-parçacık karakterizasyon teknikleri bu nedenle çok daha olumlu nanoparçacık ve fonksiyonlaşmış nanoparçacık sistemlerini analiz etmek vardır.

RPS tabanlı teknolojiler bir numuneye bir elektrik alanı uygulanması ve bir sentetik veya biyolojik nano-gözeneklere içinde parçacık taşıma mekanizması takip etrafında dayanmaktadır. RPS dayalı nispeten yeni nanoparçacık algılama ve karakterizasyonu tekniği ayarlanabilir direnç darbe algılama (TRPS) ^8-16 olduğunu. TRPS bir elastomerik, ayarlanabilir bir gözenek membran ile ayrılmış, iki elektrod sistemidir. Ayarlanabilir bir gözenek yöntem, trans-ölçülebilir şekil ¹⁷ ve boyutu, bir dizi analitlerin sağlargözenek yoluyla liman mekanizmaları. Ayarlanabilir gözenekler, daha önce bu transmisyon elektron spektroskopisi ^{(TEM), 10} gibi başka teknikler ile karşılaştırılabilir sonuçlar elde küçük parçacıkların saptanması (70-95 nm çapında) kullanılmıştır. bir elektrik alanı uygulandığında, iyonik akımı görülmektedir ve parçacıklar / molekülü gözenek geçerken, geçici olarak bir "blokaj etkinliği" olarak tanımlanabilir mevcut bir azalmaya neden gözenek bloke eder. Bir örnek içindeki her parçacık, özelliği tek tek blok büyüklüğü, ö göre böylece, her blokaj etkinliği tek bir parçacık temsili Ve tam genişliği yarım maksimum FWHM, hem de diğer blokaj özellikleri. bir nanopore geçerken tek tek parçacıkların analiz parçacık amon boyutları ve TRPS başarılı ve etkili bir dizi ayırt gibi multimodal numuneler için avantajlıdırTek bir örnek GST. Ayarlanabilir direnç darbe algılama boyutu ^10, tek bir vadede aynı anda zeta potansiyeli ^12,18 ve konsantrasyon ¹⁵ ölçümleri tamamlar ve hala benzer örnekleri ayırt nedenle eğer kendi yüzey yükü ¹⁹ tarafından değil aynı boyutta; Alternatif boyutlandırma teknikleri üzerinde bir avantaj.

Zeta potansiyeli kesme ²⁰ düzleminde elektrostatik potansiyel olarak tanımlanır ve bir gözenek ¹⁹ çapraz olarak parçacık hızları hesaplanır. Bireysel partiküllerin zeta potansiyel ölçümleri böylece translokasyon mekanizmaları ve çözelti içinde nanoparçacık sistemleri, uygulamaları bir dizi için nanoparçacık tahlil tasarımları geleceği için değerli bilgilerin davranış içine bir fikir verir. Bu tür doğa parçacık-by-parçacık analizi de o daha fazla bilgi için izin veren bir örnek halk arasında yayıldı ve zeta potansiyeli değerlerinin dağılımı keşfedilmeyi sağlarçözelti içinde n tepkime kinetik (örneğin, iki-şeritli DNA, tek bükümlü) ve partikül stabiliteleri elde edilmesi.

Burada, algılar ve değiştirilmemiş ve DNA modifiye SPP yüzeyleri hem karakterize bir tekniği açıklar. Burada tarif edilen protokol, inorganik ve biyolojik nanopartiküllerin bir dizi için geçerli olmakla birlikte, bağlı uygulama bunların geniş bir DNA modifiye edilmiş yüzeyler kullanılarak prosedürü göstermektedir. tekniği Kullanıcı böylece partikül translokasyon bir gözenek sistemi ile hızları ve zeta potansiyeli göre bir nanopartikül yüzey üzerinde tek sarmallı ve çift sarmallı DNA hedefleri ayırt sağlar.

Protocol

1. Tween-20 (PBST) Tamponu ile fosfat tamponlu tuzlu su yapma 200 ml deiyonize su (18.2 cm) bir PBS tablet (0.01 M fosfat tamponu, 0.0027 M potasyum klorür, 0.137 M sodyum klorür, pH 7.4) içinde çözülür. bir yüzey aktif madde olarak 200 ml tampon çözeltiye 100 ul (0.05 (hac / hac)%) Tween-20 ekleyin. 2. Karboksil Polistiren Parçacık Standartları Hazırlama parçacıkların bir tekli dağılırlık oluşturmak için 80 watt olarak 2 dakika bo…

Representative Results

Manyetik saflaştırma ve TRPS ölçüm süreçlerinin 1. şematik gösterimi Şekil. Bir numune içeren fazlalığı, ilişkisiz yakalama prob DNA. B) ile başlayan numunenin manyetik arınma A) Örnek ölçüm örnek TRPS i) Parçacık geçici bir azalmaya neden nanopore geçerek ve ii) Blokaj olay gözenek parçac…

Discussion

Zeta potansiyeli için hesaplama Arjmandi ve ark., ²¹ işe ilişkin bir kalibrasyon tabanlı yöntem kullanılır. parçacıkların translokasyonu süresi bir nanopore düzenli konik gözenek tümü boyunca bir ortalama elektrik alanı ve parçacık hızları kullanılarak, uygulanan voltajın bir fonksiyonu olarak ölçülür çapraz olarak. Elektroforetik mobilite algılama bölgesi uzunluğunun karesine, l ile çarpılan gerilime göre (T blokajı süresi) 1 / T türevidir. algılam…

Materials

Phosphate buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich, UK	P4417	1 tablet dissolved in 200 mL deionised water to make buffer solution.
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles	Bangs Laboratories, US	CPC200	Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1E12 particles/mL, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2E19 C/nm^2.
Streptavidin coated nanoparticles	Ademtech, France	3121	Batch had binding capacity of 4352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1E11 particles/mL.
Biotinylated oligonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCAC TACGCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary – 5'GCCACGCGTAGTGAGGTTTAACCAT3', Middle binding – 5'GTAGTGAGGT3', End binding – 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging – 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano	Izon Science, NZ		Inherent pressure on system of 47 Pa,
Izon Variable Pressure Module (VPM)	Izon Science, NZ		Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 1000 Pa.
Polyurethane nanopore membranes	Izon Science, NZ	NP150	Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch.
Magrack 6	GE Healthcare, UK	28-9489-64
Sonic Bath	Fisher Scientific, UK	10692353	80 Watts
Vortexer	IKA, Germany	0003365000
Rotary Wheel	Labnet International, US	H5500-230 V